Derivação e cultura de células-tronco embrionárias em substratos quimicamente definidos

Abstract

Linhagens de células tronco embrionárias para uso em terapia regenerativa devem ser criadas e mantidas sob condições restritas, excluindo o uso de suplementos indefinidos. Duas etapas fundamentais na criação de uma nova linhagem de células tronco embrionárias são a aderência ao substrato exposto e sua derivação até a formação de uma nova colônia primária. Além da possibilidade de emprego em sua espécie, o estudo com células bovinas serve como modelo para produção de células tronco embrionárias humanas, eliminando barreiras éticas e morais para pesquisas com material genético humano. Embriões bovinos foram usados para testar diferentes hidrogéis como substrato para derivação de células-tronco. O polímero sintético PVA, poli (álcool vinílico), foi utilizado para obter hidrogéis funcionalizados com a sequência tetrapeptídica RGDS (arginina-glicina-aspartato-serina) e reticulações com moléculas de acido cítrico e o acido 1,2,3,4-butano tetracarboxílico (BTCA). Os substratos foram testados para citotoxicidade celular utilizando células do cumulus (CCs). As CC’s demonstraram morfologia celular normal, sem sinais de lise ou degeneração, porém notou-se ausência de proliferação nas amostras com ausência da reticulação com o BTCA. Em um segundo experimento, massas celulares de 20 embriões bovinos foram isoladas e divididas em dois grupos. O primeiro sendo marcado pelo uso de hidrogéis contendo 10% de PVA na sua composição reticulado com BTCA e o segundo apresentando 20% de PVA na sua composição e reticulado com BTCA. Em duas repetições houve uma satisfatória taxa de adesão de 20% nos substratos e sinais de uma possível derivação no substrato contendo 20% de PVA. Esses resultados motivam a aperfeiçoar nossas formulações de hidrogéis para aumento das taxas de adesão e proliferação de células tronco embrionárias sob condições definidas e potencial uso terapêutico em medicina regenerativa.

Embryonic stem cells (ESC) to be used for cell therapies must be created and maintained under strict conditions, excluding the use of undefined supplements. Two key steps in the creation of a new embryonic stem cell line are adherence to the substrate and derivation towards the formation of a primary colony. Bovine embryonic stem cells (ESCs) may be used as a model for the development of ESCs, minimizing legal and ethical issues that impair the use of human gametes and embryos for research. Bovine embryos were used to test different hydrogels as substrate for ESC derivation. The synthetic polymer PVA, poly (vinyl alcohol), was used to obtain functionalized hydrogels with the tetrapeptide L-arginyl-glycylL-aspartyl-L-serine (RGDS) sequence and crosslinked with citric acid and 1, 2, 3, 4- butanetetracarboxylic acid (BTCA) molecules. The substrates were tested for cellular citotoxicity using cumulus cells (CC’s). The CC’s showed normal cellular morphology, any signal of lyses or degeneration, however, in the sample without BTCA presence low proliferation was observed. In a second series of experiments, the Inner cell mass of 20 bovine embryos were isolated and divided in two groups. The first was characterized by composition of 10% of concentration of PVA and the second by composition of 20% of PVA, both were crosslinked with 1% of BTCA. In two repetitions, the results showed a good rate of inner cell mass (ICM) adherence on the substrates and signals of a possible derivation on the hydrogel containing 20% PVA. These results encourage us to improve the present hydrogel formulations to increase the rates of derivation and cell proliferation under defined cultured conditions to comply with good manufacturing practice directives for the potential therapeutic use of ESCs.