Interação entre células mesenquimais adipoderivadas e scaffold de poli (ácido lático-co-glicólico) e poli (isopreno) epox confeccionado a partir de centrifugal spinning : estudo in vitro

Abstract

A engenharia de tecidos compreende o uso de células tronco mesenquimais associadas com biomateriais, tendo como finalidade o reparo, regeneração e restauração de tecidos lesados. O objetivo desse trabalho foi avaliar a interação entre células mesenquimais adipoderivadas de humanos com scaffold de PLGA/PI epox, confeccionado através da técnica de centrifugal spinning. Preconizou-se, a partir de testes in vitro, o estabelecimento da melhor densidade de plaqueamento entre 0,325x105 [0,325x10 elevado a 5], 0,65x105 [0,65x10 elevado a 5] e 1,3x105 [1,3x10 elevado a 5] e melhor tempo de cultivo entre 24, 48 ou 72 horas. A partir das características fibroblastóides, aderência a garrafas plásticas de cultivo celular, diferenciação em linhagens adipogênicas e osteogênicas e imunofenotipagem positiva para CD90 e CD105 e negativa para CD34 e CD45, as células utilizadas neste estudo foram consideradas tronco mesenquimais. A integração das células à matriz fibrosa foi observada por meio de microscopia eletrônica de varredura, onde foi possível evidenciar a emissão de pseudópodes celulares. As fibras confeccionadas pela técnica de centrifugal spinning apresentaram-se fibrosas e porosas, com diâmetro médio de 3,61±2,81μm, tendo uma maior representatividade de fibras com 1μm (n=113). A atividade metabólica das células cultivadas junto ao biomaterial foi similar aos seus respectivos controles (células aderidas no fundo da placa, padrão ouro) (p>0,05). A exceção evidenciada entre os grupos testes e controle, perante ao teste de MTT, foi notória no cultivo de 1,3x105 [1,3x10 elevado a 5] em 72 horas, onde as células cultivadas junto ao scaffold mostraram-se metabolicamente mais ativas que o controle (2,87±0,30; 2,18±0,15, p>0,05), demonstrando a não interferência do biomaterial na viabilidade celular. A menor absorbância foi no grupo de 0,325x105 [0,325x10 elevado a 5] ADSCs (0,69±0,19; 1,27±0,46; 1,25±0,43, diferindo em todos os tempos de avaliação em relação ao grupo de 1,3x105 [1,3x10 elevado a 5] células (1,96±0,53; 2,45±0,26; 2,87±0,30, p<0,05), porém foi homogênea ao plaqueamento de 0,65x105 [0,65x10 elevado a 5] (1,02±0,24; 2,07±0,71; 1,77±0,56, p>0,05). Esse último, apresentou menor absorbância quando contrastado ao grupo de maior densidade nas avaliações de 24 e 72 horas (p<0,05). Perante a coloração do citoesqueleto celular, não foram demonstradas alterações quando as células foram cultivadas junto as matrizes fibrosas, independente do tempo de incubação e densidade. A contagem celular foi realizada por meio da coloração nuclear com DAPI, onde a maior média obtida por campo foi no plaqueamento de 1,3x105 [1,3x10 elevado a 5] células, durante 24 horas (529±81,70). Porém, há uma tendência ao descolamento celular com o passar das horas, podendo se justificar pelas forças moleculares atuantes entre o scaffold e as células e por ter um número alto de células aderidas incialmente. Porém, as células retornam a proliferar em 72 horas de avaliações. Fundamentado nos achados descritos acima, constatamos que o plaqueamento de 1,3x105 [1,3x10 elevado a 5] por 24 horas foi o mais eficaz. Ademais, o uso do biomaterial junto ao cultivo durante três dias de avaliações, não interferiu na viabilidade e morfologia das células. Segundo esses resultados, associação entre PLGA/PI epox e células mesenquimais adipoderivadas podem ser consideradas para futuros estudos in vivo na engenharia de tecidos.

Tissue engineering comprises the use of mesenchymal stem cells associated with biomaterials, with the purpose of repairing, regenerating and restoring damaged tissues. The aim of this work was to evaluate the interaction between human adipoderivated mesenchymal cells with PLGA/PI epox scaffold, made using the centrifugal spinning technique. It was recommended, based on in vitro tests, the establishment of the best plating density between 0.325x105 [0,325x10 to the power 5], 0.65x105 [0,65x10 to the power 5] and 1.3x105 [1,3x10 to the power 5] and the best culture time between 24, 48 or 72 hours. From fibroblastoid characteristics, adherence to plastic bottles of cell culture, differentiation into adipogenic and osteogenic lines and positive immunophenotyping for CD90 and CD105 and negative for CD34 and CD45, the cells used in this study were considered mesenchymal stem. The integration of cells in the fibrous matrix was observed by means of scanning electron microscopy, where it was possible to evidence the emission of cellular pseudopods. The fibers made by the spinning centrifugal technique were fibrous and porous, with an average diameter of 3.61±2.81μm, with a greater representation of fibers with 1μm (n = 113). The metabolic activity of cells grown next to the biomaterial was similar to their respective controls (cells adhered to the bottom of the plate, gold standard) (p> 0.05). The exception shown between the test and control groups, compared to the MTT test, was evident in the cultivation of 1.3x105 [1,3x10 to the power 5] in 72 hours, where cells cultured next to the scaffold were more metabolically active than the control (2.87±0.30; 2.18±0.15 p>0.05), demonstrating the non-interference of the biomaterial in cell viability. The lowest absorbance was in the group of 0.325x105 [0,325x10 to the power 5] ADSCs (0.69±0.19; 1.27±0.46; 1.25±0.43, differing at all times in relation to the 1.3x105 [1,3x10 to the power 5] group cells (1.96±0.53; 2.45±0.26; 2.87±0.30, p <0.05), but it was homogeneous at 0.65x105 [0,65x10 to the power 5] (1.02± 0.24; 2.07±0.71; 1.77±0.56, p> 0.05) .The latter showed lower absorbance when compared to the group with higher density in the 24 and 72 hour evaluations (p<0.05). Due to the staining of the cell cytoskeleton, no changes were demonstrated when the cells were cultured with fibrous matrices, regardless of the incubation time and density. Cell count was performed by means of nuclear staining with DAPI, where the highest average obtained by field was in the plating of 1.3x105 [1,3x10 to the power 5] cells for 24 hours (529±81.70). However, there is a tendency for cell detachment over time, which may be justified by the molecular forces acting between the scaffold and the cells and for having a high number of cells adhered initially. However, the cells return to proliferate in 72 hours of evaluations. Based on the findings described above, we found that the plating of 1.3x105 [1,3x10 to the power 5] for 24 hours was the most effective. In addition, the use of biomaterial with the culture during three days of evaluations, did not interfere in the viability and morphology of the cells. According to these results, an association between PLGA/PI epox and adipoderivated mesenchymal cells can be considered for future in vivo studies in tissue engineering.