Caracterização molecular de isolados de Klebsiella pneumoniae resistentes às polimixinas

Abstract

Este estudo teve como objetivo realizar a caracterização molecular de isolados de Klebsiella penumoniae resistentes às polimixinas, com foco em alterações cromossomais. Um total de 35 isolados clínicos de K. pneumoniae resistentes aos carbapenêmicos e a polimixina B de 3 hospitais em Porto Alegre no período de abril de 2013 a agosto de 2015 foram incluídos no estudo. Todos os 35 isolados de K. pneumoniae apresentaram os genes pmrA, pmrB, pmrD, phoP e phoQ com o tamanho molecular esperado, indicando que nenhuma deleção ou inserção parcial ocorreu nesses genes. Nenhum dos isolados apresentou reação de PCR positiva para o gene mcr-1. A PCR para o gene mgrB foi positiva em 34 dos 35 isolados avaliados sendo que 23 isolados apresentaram o gene com o tamanho de aproximadamente 144 pares de base indicando que o mesmo estava intacto. Por outro lado, 11 isolados de K. pneumoniae (32,4%) apresentaram amplicons de mgrB com tamanho aumentado (em torno de 1500 bp), o que é compatível com a presença de IS. Um isolado apresentou resultado negativo na PCR para o gene mgrB, sugerindo deleção total do gene. Os 12 isolados resistentes aos carbapenêmicos e polimixina B com alteração no gene cromossomal mgrB tiveram seu genoma completo sequenciado. Os dados do sequenciamento foram processados e analisados com a utilização de ferramentas de bioinformática apropriadas (https://patricbrc.org; http://www.genomicepidemiology.org; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), sendo comparados com sequências de referências depositadas. Genes relatados como responsáveis pela resistência à polimixina, como mgrB, pmrA, pmrB, pmrD, phoP e phoQ foram também analisados com os dados gerados pelo sequenciamento de todo genoma. Os 11 isolados clínicos com mgrB alterado (amplicon com tamanho molecular aumentado) tiveram seus dados se NGS analisados na plataforma National Center for Biotechnology Information (NCBI) por similaridade a sequências referências. Desta forma, foi possível identificar 5 famílias diferentes de IS: 5 isolados interrompidos por sequências da família IS5 (45,5%), 3 isolados da família ISKpn13 (27,3%) e 1 isolados das respectivas famílias: IS1, IS3 e IsKpn26. Um único isolado não mostrou amplificação do gene mgrB, sendo posteriormente confirmado a deleção por sequenciamento do genoma completo. Conforme nosso conhecimento, esses são os primeiros relatos de inserção de IS3, além de deleção total mutando o gene mgrB, em isolados provenientes do Brasil. Embora os resultados da técnica de PCR com primers para os outros genes relacionados a resistência cromossomal à polimixina (pmrA, pmrB, pmrD, phoP e phoQ) tenha indicado que todos estavam presentes e que não apresentavam alteração no tamanho molecular, foi possível identificar mutações missense e silenciosas através da análise dos dados de sequencimamento do genoma completo. As mutações encontradas incluiram: pmrA – missense mutation no isolado 4110 (L64R, D167E); pmrB – mutação missense no isolado 966 (S164P) e isolado 3854 (V300F), mutações missense e silenciosa no isolado 4110 (A84G, G111V, P145P, L233L); pmrD – mutação silenciosa (L25L); e phoQ – mutação silenciosa no isolado 4110 (I148I, S301S, D416D). Além de genes relacionados a resistência à polimixina, outros genes foram identificados a partir da análise in silico dos dados do sequenciamento de todo genoma: blaKPC e blaNDM (resultado esperado visto que os isolados eram resistentes aos carbapenêmicos), enzimas modificadoras de aminoglicosídeos incluindo acetiltransferases, fosfotransferases e nucleotidiltransferases; genes tet que conferem resistência a tetraciclinas bem como blaCTX-M que confere resistência a beta-lactâmicos. Os dados de sequenciamento confirmaram que nenhum isolado apresentava o gene mcr-1. Para determinar a sequence type (ST) dos isolados, os sete genes housekeeping (gapA, infB, mdh, pgi, phoE, rpoB e ton) foram avaliados in silico. Foram identificadas 4 diferentes STs, 6 isolados pertenciam a ST437 (50,0%), 4 isolados a ST11 (33,3%), 1 isolado a ST16 e 1 a ST340 (8,3%). Nossos resultados corroboraram com relatos anteriores sobre a resistência, mas também indicaram a complexidade que pode estar envolvida, muitas vezes tendo mais de um mecanismo envolvido na resistência. Cabe mencionar que um isolado com o gene mgrB com deleção total e um isolado com sequência de inserção IS3 alterando o gene, ambas as alterações não descritas anteriormente no Brasil.

This study aimed to carry out the molecular characterization of Klebsiella penumoniae isolates resistant to polymyxins, focusing on chromosomal alterations. A total of 35 clinical isolates of K. pneumoniae resistant to carbapenems and polymyxin B from 3 hospitals in Porto Alegre from April 2013 to August 2015 were included in the study. All 35 isolates of K. pneumoniae had the pmrA, pmrB, pmrD, phoP and phoQ genes with the expected molecular size, indicating that no deletion or partial insertion occurred in these genes. None of the isolates showed a positive PCR reaction for the mcr-1 gene. The PCR for the mgrB gene was positive in 34 of the 35 isolates evaluated, with 23 isolates presenting the gene with the size of approximately 144 base pairs indicating that it was intact. On the other hand, 11 (32.4%) isolates of K. pneumoniae presented increased mgrB amplicons (around 1500 bp), which is compatible with the presence of IS. One isolate had a negative PCR result for the mgrB gene, suggesting complete deletion of the gene. The 12 isolates resistant to carbapenems and polymyxin B with changes in the chromosomal gene mgrB had their genome all sequenced. The sequencing data were processed and analyzed using appropriate bioinformatics tools (https://patricbrc.org;http://www.genomicepidemiology.org;https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/), being compared with deposited reference strings. Genes reported to be responsible for polymyxin resistance, such as mgrB, pmrA, pmrB, pmrD, phoP and phoQ were also analyzed with the data generated by sequencing the entire genome. The 11 clinical isolates with altered mgrB (amplicon with increased molecular size) had their NGS data analyzed on the National Center for Biotechnology Information (NCBI) platform for similarity to the reference sequences. Thus, it was possible to identify 5 different IS families: 5 isolates interrupted by IS5 family sequences (45.5%), 3 isolates from the ISKpn13 family (27.3%) and 1 isolate from the respective families: IS1, IS3 and IsKpn26. A single isolate did not show amplification of the mgrB gene, and the deletion was confirmed by sequencing the complete genome. To our knowledge, these are the first reports of insertion of IS3 and total deletion mutating the mgrB gene, in isolates from Brazil. Although the results of the PCR technique with primers for the other genes related to chromosomal resistance to polymyxin (pmrA, pmrB, pmrD, phoP and phoQ) indicated that all were present and that there was no change in molecular size, it was possible to identify missense mutations and silent by analyzing the complete genome sequencing data. The mutations found included: pmrA - missense mutation in isolate 4110 (L64R, D167E); pmrB - missense mutation in isolate 966 (S164P) and isolate 3854 (V300F), missense and silent mutations in isolate 4110 (A84G, G111V, P145P, L233L); pmrD - silent mutation (L25L); and phoQ - silent mutation in isolate 4110 (I148I, S301S, D416D). In addition to genes related to polymyxin resistance, other genes were identified from in silico analysis of sequencing data for the entire genome: blaKPC and blaNDM (expected result since the isolates were resistant to carbapenems), aminoglycoside-modifying enzymes including acetyltransferases, phosphotransferases and nucleotidyltransferases; tet genes that confer resistance to tetracyclines as well as blaCTX-M that confers resistance to betalactams. The sequencing data confirmed that no isolate had the mcr-1 gene. To determine the sequence type (ST) of the isolates, the seven housekeeping genes (gapA, infB, mdh, pgi, phoE, rpoB and ton) were evaluated in silico. Four different STs were identified, 6 isolates belonging to ST437 (50.0%), 4 isolates to ST11 (33.3%), 1 isolate to ST16 and 1 to ST340 (8.3%). Our results corroborate previous reports on resistance, but they also indicated the complexity that may be involved, often having more than one mechanism involved in resistance. It is worth mentioning that an isolate with the mgrB gene with total deletion and an isolate with an IS3 insertion sequence altering the gene, both alterations not previously described in Brazil.