Estudo funcional do fator de transcrição Pdr802 na biologia do patógeno Cryptococcus neoformans

Abstract

Cryptococcus neoformans é o agente etiológico da criptococose, enfermidade que afeta principalmente pacientes imunocomprometidos e causa aproximadamente 180.000 óbitos no mundo anualmente. Uma vez em contato com o hospedeiro, este patógeno é exposto à uma variedade de processos adaptativos, os quais são regulados por uma rede de fatores de transcrição (FTs). Dentre eles, destaca-se o FT Pdr802, já previamente caracterizado como um importante regulador da patogênese de C. neoformans. Na presente Tese, demonstramos que a expressão do gene codificador de Pdr802 é altamente induzida em condições que mimetizam o ambiente do hospedeiro in vitro, e que sua inativação afeta a sobrevivência de C. neoformans em um hospedeiro mamífero, no soro murino e em meio de cultura de células. Dois importantes determinantes de virulência deste patógeno são negativamente regulados por Pdr802: a produção da cápsula polissacarídica e de células gigantes (Titan cells). Ambos fenótipos elucidam a disseminação limitada do mutante nulo pdr802 para o Sistema Nervoso Central (SNC) e a consequente redução da virulência dessa linhagem, uma vez que células hipercapsulares e gigantes demonstram taxas de fagocitose por macrófagos reduzidas e ineficiência em ultrapassar diretamente barreiras biológicas. Utilizando ensaio de imunoprecipitação de cromatina seguido de sequenciamento (ChIP-Seq), associado ao sequenciamento de RNA (RNA-Seq), identificamos alvos diretos de Pdr802, que incluem as proteínas relacionadas com quorum sensing Pqp1, Opt1 e Liv3 e os fatores de transcrição Stb4, Zfc3 e Bzp4, importantes para a infecção do cérebro e regulação do tamanho da cápsula polissacarídica de C. neoformans. Alvos adicionais incluem as proteínas reguladas pela via da calcineurina, Had1 e Crz1, importantes para o remodelamento da parede celular e virulência de C. neoformans, e genes envolvidos na resistência à temperatura do hospedeiro, ao estresse oxidativo e atividade de urease. O papel de Pdr802 como regulador negativo da formação de células gigantes e da cápsula polissacarídica, assim como regulador positivo de quorum sensing, são críticos para a patogenicidade de C. neoformans.

Cryptococcus neoformans is the etiological agent of cryptococcosis, an infectious disease that affects mainly immunocompromised patients and causes 180,000 deaths worldwide each year. Once inside the host, cryptococcal cells undergo a variety of adaptative processes that are regulated by a network of transcription factors (TFs). One of these is the TF Pdr802, which have been already shown as an important regulator of C. neoformans pathogenicity. In this work, we demonstrated that the Pdr802 coding gene expression is highly induced under host like conditions in vitro and its deletion impairs C. neoformans survival in a mammalian host, mouse serum, and tissue culture media. Two important cryptococcal virulence determinants are negatively regulated by Pdr802: the polysaccharide capsule and Titan cells production. Both of these phenotypes explain the limited dissemination of pdr802 null mutant cells to the central nervous system and the consequently reduced virulence of this strain, as hypercapsular strains and Titan cells are less phagocyted by macrophages and have diminished ability to directly cross biological barriers. Using chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq), as well as RNA sequencing (RNA-Seq), we identified directly targets of Pdr802, which include the quorum sensing related proteins Pqp1, Opt1, and Liv3 and the transcription factors Stb4, Zfc3 and Bzp4, which regulate cryptococcal brain infectivity and capsule thickness. Additional targets comprise the calcineurin-regulated proteins Had1 and Crz1, important for cell wall remodeling and C. neoformans virulence; and genes related to resistance to host temperature and oxidative stress, and to urease activity. The role of Pdr802 as a negative regulator of Titan cell formation and capsule thickness, as well as a positive regulator of quorum sensing are thus critical for cryptococcal pathogenicity.