Hiperplasia adrenal congênita : predição e elucidação do efeito de mutações no gene CYP21A2 humano na estrutura e na atividade da enzima 21- hidroxilase

Abstract

Contexto A hiperplasia adrenal congênita (HAC) devido à deficiência da CYP21A2 é uma doença genética com um amplo espectro fenotípico e bom prognóstico quando o portador é acompanhado e tratado corretamente. A análise genética do gene CYP21A2 é considerada uma peça-chave em casos complexos, principalmente em portadores assintomáticos e casos positivos. Portanto, ferramentas acessíveis para inferir a patogenicidade de novas variantes e a elucidação de variantes não caracterizadas são essenciais para um diagnóstico preciso. Objetivo Investigar a patogenicidade de variantes não caracterizadas no CYP21A2 reportadas nas populações brasileiras ou portuguesas, além de analisar o desempenho de ferramentas de predição in silico para categorizar variantes missense do CYP21A2. Métodos Ferramentas computacionais de predição de dano e modelelagem estrutural foram usadas para analisar a conservação de resíduos e alterações físico-químicas e estruturais de variantes não caracterizadas encontradas nas populações brasileira ou portuguesa. A atividade residual da enzima foi obtida por ensaio funcional através das proteínas CYP21A2 do tipo selvagem e mutantes expressas em células HEK293. Ademais, nós acessamos o desempenho de preditores in silico através de variantes do CYP21A2 caracterizadas in vitro por ensaio funcional. No total, 103 variantes foram usadas para testar dezessete programas de predição de dano, treze simples e quatro metapreditores. Resultados As análises computacionais e funcionais de variantes não caracterizadas mostraram que todas as seis variantes selecionadas diminuem a atividade da CYP21A2. As variantes p.P35L e p.L199P causam uma atividade parcial da enzima, correspondente à forma tardia de HAC. Enquanto, as variantes p.W202R, p.E352V p.P433L e p.R484L diminuem a atividade da enzima a um nível residual compatível com a forma clássica virilizante simples. Quanto ao desempenho das ferramentas de predição, todos os programas testados foram capazes de identificar variantes patogênicas. As acurácias obtidas variaram entre 0,69 e 0,97 e o MCC entre 0,49-0,90, sendo que os melhores valores foram obtidos para os programas CADD, ConSurf, DANN e ProlyPhen-2. O programa PANTHERPSEP não foi capaz de identificar variantes neutras. Conclusão Elucidamos o impacto na estrutura e na funcionalidade de seis variantes com perfis desconhecidos, e mostramos boa correlação entre os estudos in silico e in vitro. Além disso, identificamos quatro programas de predição com bom desempenho para classificar variantes patogênicas e neutras na proteína CYP21A2. Portanto, esse estudo enfatiza a importância de se usar múltiplas ferramentas de predição em conjunto e contribui para futuras análises genéticas da deficiência da CYP21A2.

Context Congenital adrenal hyperplasia (CAH) due to CYP21A2 deficiency is a genetic disease with a broad phenotypic spectrum and good prognosis when the carrier is followed-up and treated correctly. Genetic analysis of CYP21A2 gene is considered a key component in complex CAH phenotypes, mainly with asymptomatic carriers and false positive cases. Therefore, accessible tools to infer the pathogenicity of new variants and the elucidation of uncharacterized variants are essential to a precise diagnosis. Aim Investigate the pathogenicity of uncharacterized variants in the CYP21A2 reported in the Brazilian or Portuguese populations and analyze the performance of in silico prediction tools to categorize missense variants of the CYP21A2. Methods Computational tools of damage prediction and structural modeling were used to analyze the conservation of residues and physicochemical and structural changes of uncharacterized variants found in the Brazilian or Portuguese populations. The residual enzyme activity was obtained by functional assay with wild-type and mutants CYP21A2 proteins expressed in HEK293 cells. Furthermore, we accessed in silico predictors performance through variants of the CYP21A2 characterized in vitro by functional assays. In total, 103 variants were used to test seventeen predictors’ programs, thirteen single-predictors and four meta-predictors. Results Computational and functional analyzes of uncharacterized variants showed that all six selected variants decrease the CYP21A2 activity. The variants p.P35L and p.L199P cause partial enzyme activity, corresponding to the late form of CAH. Whereas the variants p.W202R, p.E352V, p.P433L, and p.R484L decrease the enzyme activity to a residual level compatible with the classic simple virilizing form. Concerning the performance of the in silico predictor tools, all programs were able to identify pathogenic variants. The accuracies obtained ranged between 0.69 and 0.97 and the MCC between 0.49-0.90, and the better accuracy and MMC were obtained with CADD, ConSurf, DANN and ProlyPhen-2. The program PANTHER-PSEP was not able to identify neutral variants. Conclusion We elucidated the enzyme structure and functionality impact of six variants with unknown profiles, and we showed good correlation between in silico and in vitro studies. Furthermore, we identified four predictors’ programs with good performance to discriminate pathogenic and neutral variants of the CYP21A2 protein. Therefore, this study emphasizes the relevance of using multiple algorithms together and contributes to future genetic analysis of the CYP21A2 deficiency.