Análise multifatorial dos moduladores da gravidade da anemia falciforme e a exploração racional dos parâmetros na estratificação do perfil fenotípico como ferramenta para predição da gravidade, potencial de utilidade clínica e acessibilidade à terapia individualizada

Abstract

A anemia falciforme (AF) é hoje a doença genética mais prevalente mundialmente, caracterizada por um alto índice de morbimortalidade e considerada como a mais grave dentre as doenças falciformes. Características genéticas dos indivíduos além da possível heterogeneidade das moléculas associadas à hemólise e vasculopatia são responsáveis por uma variedade de manifestações e complicações clínicas. Embora seja uma patologia monogênica ocasionada por uma única mutação, fatores genéticos e ambientais têm demonstrado um papel fundamental nas variações de gravidade da doença. Atualmente a classificação da patologia se dá através das taxas de crises de dor, com uma abrangência muito restrita para uma doença multifatorial. Diante deste contexto, o estudo teve como objetivo principal a análise multifatorial dos possíveis moduladores da gravidade da Anemia Falciforme e a exploração racional destes parâmetros nos mecanismos reguladores e de danos na estratificação do perfil fenotípico como ferramenta para posterior predição de gravidade e terapia individualizada. Caracteriza-se por um estudo pioneiro do tipo de pesquisa clínica de coorte. Foram incluídos neste estudo 197 indivíduos, dos quais, 65 indivíduos normais sem a patologia, doadores do banco de sangue do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), e 132 pacientes homozigotos SS, em acompanhamento médico no Centro de Referência em Doença Falciforme do HCPA, e incluiu uma análise de 97 variáveis. A obtenção de dados se deu através de análise de parâmetros genéticos (polimorfismos e microRNAs), parâmetros laboratoriais (hematológicos e bioquímicos), parâmetros clínicos e análise do perfil inflamatório (citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento). As variantes genéticas foram genotipadas por amplificação de análise de PCR em tempo real, Taqman. Os riscos relativos para o desenvolvimento de cada manifestação clínica da doença e gravidade fenotípica foram calculados para os genótipos em Xmn1-HBG2 (rs7482144); o BCL11A (rs1427407, rs4671393 e rs11886868); e HMIP-2 (rs9399137 e rs9402686) e suas associações foram testadas. Para os microRNAs foram comparadas as diferenças dos perfis de expressão de cada microRNAa com a média do grupo controle, sua associação com os parâmetros clinicopatológicos, correlações entre as variáveis hematológicas e bioquímicas com a finalidade de avaliar a influência entre as variáveis, além do valor prognóstico destes microRNAs para a gravidade da doença, através da curva ROC. Citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento foram avaliados através da plataforma Luminex, onde 30 analitos foram medidos simultaneamente (EGF; HGF; VEGF; MIG; RANTES; Eotaxina; IL-8; GM-CSF; TNF alfa; IL-1 beta; IL-2; IL-4; IL-5; IL-6; IL-10; MIP- 1 alfa; IL-17; MIP-1 beta; IP-10; IFN alfa; IL-7; IL-15; MCP-1; G-CSF; IL-2R; IFN gama; FGF-Basic; IL-1RA; IL-12 e IL-13) e comparados com grupo controle (HbAA). Para testar a hipótese de que níveis sistêmicos destas moléculas poderiam estar associados a variabilidade fenotípica da doença, investigamos as associações com escores de gravidade e aspectos clinicopatológicos. Concluiu-se que 2 locis possuem uma possível relação genética com determinadas manifestações clínicas e níveis de distribuição de HbF e que, a presença de alelos específicos pode atribuir riscos crescentes de complicações clínicas de acordo com a manifestação do alelo no genótipo. Já a análise de microRNAs revelou 3 microRNAs diferencialmente expressos, além de correlações negativas e positivas significativas com os escores de gravidade, apresentando um bom valor prognóstico e ótimo valor preditivo para gravidade da doença. Além disso, nossos resultados mostraram maiores concentrações de citocinas inflamatórias nos pacientes em relação ao controle. E, ao avaliarmos a importância destes moduladores inflamatórios na variabilidade fenotípica, encontramos diferenças estatisticamente expressivas em pacientes que apresentavam um perfil mais grave daqueles com um perfil clínico mais brando. Ao final é apresentado um modelo multivariável de estratificação fenotípica com potenciais preditores de gravidade na tentativa de prever e definir fenótipos na AF, possibilitando um conhecimento do nível de morbimortalidade e direcionamento de novas abordagens terapêuticas individualizadas.

Sickle cell anemia (SCA) is the most prevalent genetic disease worldwide, characterized by a high morbidity and mortality rate and considered the most serious among sickle cell diseases. Genetic characteristics of individuals and the possible heterogeneity of molecules associated with hemolysis and vasculopathy are responsible for a variety of clinical manifestations and complications. Although it is a monogenic pathology caused by a single mutation, genetic and environmental factors have shown a fundamental role in variations in the severity of the disease. Currently, the pathology classification occurs through the rates of pain crises, with a very restricted scope for a multifactorial disease. Given this context, the study had as main objective the multifactorial analysis of possible modulators of the severity of Sickle Cell Anemia and the rational exploration of these parameters in the regulatory mechanisms and damage in the stratification of the phenotypic profile as a tool for later prediction of severity and individualized therapy. It is a pioneering study of clinical cohort research type. A total of 197 individuals were included in this study, of whom 65 normal individuals without the pathology, donors of the blood bank of the Hospital de Clinicas de Porto Alegre (HCPA), and 132 homozygous SS patients, under medical supervision at the Reference Center for Sickle Cell Disease HCPA, and included an analysis of 97 variables. Data were obtained through analysis of genetic parameters (polymorphisms and microRNAs), laboratory parameters (hematological and biochemical), clinical parameters, and analysis of the inflammatory profile (cytokines, chemokines, and growth factors). The genetic variants were genotyped by amplification of real-time PCR analysis, Taq-Man. The relative risks for the development of each clinical manifestation of the disease and phenotypic severity were calculated for the genotypes in Xmn1-HBG2 (rs7482144); BCL11A (rs1427407, rs4671393, and rs11886868); and HMIP-2 (rs9399137 and rs9402686) and their associations were tested. For microRNAs, the differences in the expression profiles of each microRNA were compared with the mean of the control group, its association with clinicopathological parameters, correlations between hematological and biochemical variables to assess the influence between the variables, in addition to the diagnostic value of these microRNAs for the severity of the disease, through the ROC curve. Cytokines, chemokines and growth factors were evaluated using the Luminex platform, where 30 analytes were measured simultaneously (EGF; HGF; VEGF; MIG; RANTES; Eotaxin; IL-8; GM-CSF; TNF alpha; IL-1 beta; IL -2; IL-4; IL-5; IL-6; IL-10; MIP-1 alpha; IL-17; MIP-1 beta; IP-10; IFN alpha; IL-7; IL-15; MCP- 1; G-CSF; IL-2R; IFN gamma; FGF-Basic; IL-1RA; IL-12 and IL-13) and compared with the control group (HbAA). To test the hypothesis that systemic levels of these molecules could be associated with phenotypic variability of the disease, we investigated the associations with severity scores and clinicopathological aspects. It was concluded that two loci have a possible genetic relationship with certain clinical manifestations and levels of HbF distribution and that the presence of specific alleles can attribute increasing risks of clinical complications according to the manifestation of the allele in the genotype. MicroRNA analysis revealed three microRNAs differentially expressed, in addition to significant negative and positive correlations with severity scores, presenting a good diagnostic value and excellent predictive value for disease severity. In addition, our results showed higher concentrations of inflammatory cytokines in patients compared to the control. And, when evaluating the importance of these inflammatory modulators in phenotypic variability, we found statistically significant differences in patients who had a more severe profile than those with a milder clinical profile. In the end, a multivariable model of phenotypic stratification with potential predictors of severity is presented in an attempt to predict and define phenotypes in SCA, enabling knowledge of the level of morbidity and mortality and the direction of new individualized therapeutic approaches.