Do laboratório ao manejo clínico : a hemocromatose hereditária sob as óticas epidemiológica e experimental

Abstract

A Hemocromatose Hereditária (HH) é classificada como um distúrbio autossômico recessivo caracterizado pelo aumento da absorção do ferro intestinal, podendo levar a estoques excessivos nos parênquimas hepático, cardíaco, pancreático, tireoidiano, gônadas e articulações. Com a saturação, tanto no sistema de armazenamento, bem como de transporte, o excesso do metal livre fica sujeito a reações físico-químicas, principalmente as de Fenton e Haber-Weiss, o que desencadeia uma série de cascatas inflamatórias, dano ao material genético e morte celular, resultando em insuficiências teciduais ou mesmo a tumorigênese. As variantes genéticas mais descritas são relacionadas ao gene HFE (C282Y, H63D e S65C). Outros subtipos já descritos envolvem os genes HFE2 (HJV), HAMP, SLC40A1, TRFC1 e TRFC2. O tratamento mais eficaz se dá pelo procedimento de flebotomias. O monitoramento dessa terapêutica é feito pelos exames ferritina sérica e saturação de transferrina, principalmente. Entretanto, ao se considerar o caráter multifatorial da HH, limitações quanto às ferramentas disponíveis para controle da doença são claras, não existindo nenhum biomarcador que possa ajudar na mensuração mais precoce de eventuais comorbidades secundárias à sobrecarga de ferro. Outro fator que impacta a busca por evidências nesse sentido é a escassez de dados que caracterizem esta população, sendo inexistente qualquer artigo que foque na descrição desssa no estado do Rio Grande do Sul (RS). Neste ínterim, a literatura nos apresenta algumas evidências interessantes a respeito do miR-122. Estudos pré-clínicos vinculam sua atividade a modulação de genes como o HFE, HJV e HAMP, além dos artigos em grau clínico que o associam como bom biomarcador precoce de patogenias com desfecho encontrados na HH, caso da cirrose hepática e da diabetes tipo 2. A partir deste cenário, duas questões de pesquisa foram elaboradas: Qual o perfil dos pacientes acometidos por essa condição clínica no RS? O miR-122 pode ser um bom biomarcador na HH? No intuito de achar as respectivas respostas, um projeto, divido em duas etapas, foi estruturado. A descrição clínica e laboratorial se deu a partir de uma amostragem de pacientes com diagnóstico de hiperferritinemia e em regime de sangrias terapêuticas. Além disso, o estudo contou com a análise em dois centros referência no tratamento destes casos, o Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) e o Hospital São Vicente de Paulo de Passo Fundo (HSVP-PF). Foi estabelecido o período de janeiro de 2019 a março de 2020 para recrutamento, no qual foram solicitados dados ao diagnóstico, sendo estes, ferritina, saturação de transferrina (ST), Transaminase Glutâmico Oxalacética (TGO), Transaminase Glutâmica Pirúvica (TGP), índice de massa corpórea (IMC), comorbidades e histórico familiar. Os procedimentos de sangrias terapêuticas também foram contabilizados. O exame molecular para investigação das variantes no gene HFE foi disponibilizado àqueles que não o apresentavam no recrutamento, não sendo critério de exclusão a negativa para a coleta. Foram incluídos no estudo 177 pacientes do HCPA e 57 do HSVP. Os dados foram descritos em médias, medianas e percentuais. A partir desta amostragem, um grupo de quarenta pacientes procedeceu à análise do miRNA. O critério para seleção destes levou em consideração o diagnóstico clínico e molecular de HH. Acrescido aos dados no momento do diagnóstico, idade, ferritina sérica, percentual de saturação de transferina ao recrutamento foram solicitados. A análise da expressão gênica do miR-122 foi feita a partir do isolamento do RNA, em sangue total, com kit mirVana™ PARIS™ e técnica de RT-qPCR com uso de sondas previamente testadas pelo fabricante (Thermo Scientific®). Para análise tanto do perfil ao diagnóstico, quanto ao recrutamento, além das comparações quanto ao miR- 122, os participantes foram estratificados em 3 grupos considerando os níveis de ferritina ao momento da coleta. Participantes com níveis séricos normais (abaixo de 300 ng/uL) foram alocados no grupo manutenção, e os demais em outros dois, chamados de indução 1 e 2 (indução 1 níveis entre 300 e 999 ng/uL; indução 2 níveis igual ou acima de 1000 ng/uL). A análise epidemiológica desta população gerou dados descritivos que seguiram os seguintes valores ao diagnóstico: Ferritina sérica 1029,5 ng/mL, ST 52,0%; histórico familiar em 35,0% e mediana de sangrias até o recrutamento de 7. A comorbidade em maior destaque foi a Hipertensão Arterial Sistêmica (HAS). Duzentos e quatorze participantes procederam à análise molecular e 66,4% desses apresentaram ao menos uma variante. Os genótipos de maior frequência foram os seguintes: H63D em heterozigose (21.5%), C282Y/C282Y (14.0%) e C282Y/H63D (11.8%). Quanto às variantes, uma discreta diferença na frequência alélica foi observada, sendo maior para C282Y. Na estratificação por centro, diferenças foram observadas nas variáveis clínicas, as quais podem apontar diferenças no manejo dos pacientes. A variante H63D aparece em maior número no centro HSVP-PF. Correlações entre grupos de genótipos e as variáveis clínicas também foram testadas. A estratificação feita considerou que os genótipos em homozigose e heterozigose composta para a variante C282Y tendem a apresentar maior prejuízo à função da hepcidina. Os resultados vão ao encontro da descrição na literatura, com diferenças observadas na ST e número de sangrias (p<0,001). Quando as variantes são observadas de maneira mais detalhada, C282Y em homozigose apresenta maior ST. A mesma mutação em heterozigose composta com H63D, ou S65C, é a configuração característica dos 6 pacientes que mais relataram histórico familiar positivo. Quanto ao miR-122, o grupo indução 2 apresentara maior expressão, comparada aos grupos manutenção e indução 1 (p< 0,05). Entre esses resultados, a diferença estatística entre os grupos indução chama atenção, uma vez que a variável ferritina sérica ao diagnóstico não mostra diferença estatística entre eles, assim como é visto em relação ao número de sessões de flebotomias, indicando uma provável resistência ao tratamento do grupo indução 2. Além disso, nesse grupo nota-se a presença de dois pacientes, cujas expressões relativas do miR-122 se distaciam dos demais, tendo valores que chegam a ser 20 vezes maiores. O resultado é acompanhado de uma piora dos níveis séricos de ferritina entre diagnóstico e recrutamento. Conforme já mencionado este foi o primeiro trabalho a descrever uma população do RS, assim como é pioneiro na análise do miR-122 em amostras de HH. Dentre os dados epidemiológicos, chama atenção, também, os genótipos em heterozigose simples com uma incidência considerável. Esse dado, permite levantar a hipótese da existência de variantes menos frequentes, potencialmente relacionadas aos desfechos. Em relação ao dados experimentais, a hipótese de que o miR-122 seja um bom indicador de prognóstico é reiterada, ainda que de forma incipiente, visto que o número amostral foi pequeno. Quanto a avaliação de quão precoce pode ser a sinalização de um dano tecidual a partir da análise do miR-122, estudo prospectivos devem ser delineados, comparando a expressão da referida molécula aos painéis de exames laboratoriais de ampla utilização na prática clínica.

Hereditary Hemochromatosis (HH) is an autosomal recessive disorder characterized by increased intestinal iron absorption, which can lead to excessive storage in the liver, cardiac, pancreatic, thyroid, gonads and joints parenchyma. With saturation, both in the storage and transport systems, the excess of free metal is subjected to physicochemical reactions, mainly those of Fenton and Haber-Weiss, which triggers a series of inflammatory cascades, damage to the genetic material and even cell death, resulting in tissue failure or even tumorigenesis. The most described genetic variants are related to the HFE gene (C282Y, H63D and S65C). Other subtypes already described involve the HFE2, HAMP, SLC40A1, TRFC1and TRFC2 genes. The most effective treatment is phlebotomy. Monitoring of this therapy is mainly performed by means of serum ferritin and transferrin saturation. However, when considering the multifactorial character of HH, limitations regarding the tools available to control the disease are clear, and there is no biomarker that can help in the earlier measurement of possible comorbidities secondary to iron overload. Another factor impacting the search for evidence is the scarcity of data that characterize the population of the state of Rio Grande do Sul (RS). In the meantime, the literature presents us with some interesting evidence regarding miR-122. Preclinical studies link its activity to the modulation of genes such as HFE, HJV and HAMP, in addition to clinical-grade scientific papers that associate it as a good early biomarker of pathogens with an outcome found in HH, such as liver cirrhosis and type 2 diabetes. Based on these data, two research questions were raised: What is the profile of patients affected by this clinical condition in RS? Can miR-122 be a good biomarker in HH? In order to find the respective answers, a project, divided into two stages, was structured. The clinical and laboratory description was based on a sample of patients diagnosed with hyperferritinemia and undergoing therapeutic bleeding. In addition, the study included the analysis of two reference centers in the treatment of these cases, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) and Hospital São Vicente de Paulo de Passo Fundo (HSVP-PF). The period from January 2019 to March 2020 was established for recruitment, in which diagnostic data were requested, namely, ferritin, transferrin saturation (TS), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), body mass index (BMI), comorbidities and familial history. Therapeutic bleeding procedures were also accounted. The molecular testing for the investigation of variants in the HFE gene was made available to those who did not present it at recruitment. 177 patients from HCPA and 57 from HSVP were included in the study. Data were described as means, medians and percentages. Based on this sample, a group of forty patients underwent miRNA analysis. The criteria for their selection took into account the clinical and molecular diagnosis of HH. In addition to data at diagnosis, age, serum ferritin, percent transferrin saturation at recruitment were requested. The analysis of miR-122 gene expression was performed in RNA, isolated with a mirVana™ PARIS™ kit and RT-qPCR technique using probes previously tested by the manufacturer (Thermo Scientific®). For analysis of both the profile at diagnosis and recruitment, in addition to comparisons regarding miR-122, participants were stratified into 3 groups considering ferritin levels at the time of collection. Participants with normal serum levels (below 300 ng/uL) were allocated to the maintenance group, and the others to two others, called induction 1 and 2 (induction 1 levels between 300 and 999 ng/uL; induction 2 levels equal to or above of 1000 ng/ul). The epidemiological analysis of this population generated the following data at diagnosis: Serum ferritin 1029.5 ng/mL, ST 52.0%; family history in 35.0% and median of bloodletting until recruitment of 7. The most prominent comorbidity was Systemic Arterial Hypertension (SAH). Two hundred and fourteen participants performed the molecular analysis and 66.4% of them presented at least one variant. The genotypes with the highest frequencies were: H63D in heterozygosity (21.5%), C282Y/C282Y (14.0%) and C282Y/H63D (11.8%). Regarding the variants, a slight difference in allele frequency was observed, being greater for C282Y. In the stratification by center, differences were observed in the clinical variables, which may point to differences in the management of patients. The H63D variant appears in greater numbers at the HSVP-PF center. Correlations between genotype groups and clinical variables were also tested. The stratification performed considered that the genotypes in homozygosity and compound heterozygosity for the C282Y variant tend to present greater damage to the function of hepcidin. The results are in line with the description in the literature, with differences observed in ST and number of bleeds (p<0.001). When the variants are observed in more detail, C282Y in homozygosity has higher ST. The same mutation, in compound heterozygosity with H63D or S65C, is the characteristic configuration of patients who most reported a positive family history. As for miR-122, the induction 2 group showed greater expression, compared to the maintenance and induction 1 groups (p< 0.05). Among these results, the statistical difference between the induction groups draws attention, since the serum ferritin variable at diagnosis does not show a statistical difference between them, as observed regarding the number of phlebotomies sessions, indicating a probable resistance to the treatment of induction group 2. In addition, in this group we can see the presence of two patients, whose relative expressions of miR-122 are distant from the others, with values that are up to 20 times higher. The result is accompanied by a worsening of serum ferritin levels between diagnosis and recruitment. As already explained, this was the first work to describe this population in RS, as well as being a pioneer in the analysis of miR-122 in HH samples. Among the epidemiological data, the genotypes in simple heterozygosity appear to be considerable frequent. This data allows us to hypothesize the existence of rarer variants, potentially related to the outcomes. Regarding the experimental data, the hypothesis that miR-122 is a good prognostic indicator is reiterated, albeit incipiently, since the sample number was small. Regarding the evaluation of how early the signaling of tissue damage can be observed from the analysis of miR-122, prospective studies should be designed, comparing the expression of that molecule to panels of laboratory tests widely used in clinical practice.