Metodologias para análise de amostras de leite UHT por MALDI-TOF

Abstract

O MALDI-TOF MS, Espectrometria de Massa de Tempo de Voo por Ionização de Dessorção a Laser Assistida por Matriz, é uma técnica muito utilizada na Microbiologia Clínica para identificar patógenos, principalmente, em amostras de sangue, já que seu uso permite resultados de forma mais rápida, possibilitando o tratamento e diagnóstico corretos do paciente. Estudos vêm sendo feitos para expandir os tipos de amostras que possam ser analisadas pelo MALDI-TOF quanto a sua composição microbiana, como urina, líquido cefalorraquidiano e leite. Entretanto, em algumas, o MALDI-TOF ainda requer o cultivo prévio dos microrganismos para que possam então serem analisados. Para otimizar o tempo de liberação dos resultados, pesquisadores têm testado diversos protocolos de forma a identificar os patógenos diretamente das amostras, pulando a etapa de isolamento dos microrganismos em placa. Isso favorece resultados ainda mais rápidos, resultando em melhor prognóstico dos pacientes. Todavia, para amostras de leite, existem estudos sobre a identificação de microrganismos previamente isolados pelo MALDI-TOF e raros sobre identificação direta da amostra. Diante disso, o presente estudo buscou desenvolver uma metodologia para a identificação direta de microrganismos em amostras de leite UHT pelo MALDI-TOF baseada em uma metodologia de identificação direta de amostras de sangue já publicada e, também, determinar a sensibilidade diagnóstica do MALDI-TOF. Para isso, uma amostra de leite UHT foi contaminada separadamente com nove cepas bacterianas: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enteroccocus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes e Pseudomonas aeruginosa. Foram utilizadas 3 metodologias diferentes entre si. As metodologias 1 e 2 consistiram em tratar as amostras previamente com saponina a 5%, seguida de uma extração com ácido fórmico e acetonitrila, porém foi utilizado leite semidesnatado no método 1 e leite desnatado no 2. No método 3, as amostras foram tratadas previamente com saponina a 5%, seguido por extração com isopropanol a 75% e extração com etanol etílico absoluto a 75%, ácido fórmico e acetonitrila. Nenhum dos 3 métodos obtiveram resultados de identificação por MALDI-TOF, impossibilitando também, neste caso, a determinação da sensibilidade diagnóstica para esse tipo de amostras. Supõe-se que a não identificação das amostras seja devido à composição complexa do leite, contendo lipídios que não foram solubilizados e removidos pelos métodos de extração. Acredita-se também que as proteínas do leite se sobrepuseram às proteínas das bactérias, impedindo sua detecção. Resta então, desenvolver um protocolo utilizando outro reagente para remover as proteínas e lipídeos do leite para que seja possível a identificação dos microrganismos diretamente do leite pelo MALDI-TOF.

MALDI-TOF, Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, is a technique widely used in Clinical Microbiology to identify pathogens, mainly in blood samples, as its use allows results faster, enabling the correct treatment and diagnosis of the patient. Studies have been carried out to expand the types of samples that can be analyzed by MALDI-TOF regarding their microbial composition, such as urine, cerebrospinal fluid and milk. However, in some, MALDI-TOF still requires the prior cultivation of microorganisms so that they can then be analyzed. To optimize the time it takes to release the results, researchers have been testing several protocols in order to identify pathogens directly from the samples, skipping the stage of isolating microorganisms on a plate. This favors even faster results, resulting in a better prognosis for patients. However, for milk samples, there are studies on the identification of microorganisms previously isolated by MALDI-TOF and rare on direct identification of the sample. Therefore, the present study sought to develop a methodology for the direct identification of microorganisms in UHT milk samples by MALDI-TOF based on a methodology for direct identification of blood samples already published and also to determine the diagnostic sensitivity of MALDI-TOF. For this, a sample of UHT milk was separately contaminated with nine bacterial strains: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enteroccocus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes and Pseudomonas aeruginosa. Three different methodologies were used. Methods 1 and 2 consisted of pre-treating the samples with 5% saponin, followed by extraction with formic acid and acetonitrile, but semi-skimmed milk was used in method 1 and skimmed milk in method 2. In method 3, the samples were pre-treated with 5% saponin, followed by extraction with 75% isopropanol and extraction with 75% absolute ethyl ethanol, formic acid and acetonitrile. None of the 3 methods obtained identification results by MALDI-TOF, also making it impossible, in this case, to determine the diagnostic sensitivity for this type of samples. It is assumed that the non-identification of the samples is due to the complex composition of the milk, containing lipids that were not solubilized and removed by the extraction methods. It is also believed that milk proteins overlapped the bacteria's proteins, preventing their detection. It remains then to develop a protocol using another reagent to remove proteins and lipids from milk so that it is possible to identify microorganisms directly from milk by MALDI-TOF.