Fitocistatinas em arroz (Oryza Sativa) e caracterização funcional da fitocistatina XII

Abstract

Cistatinas são inibidores competitivos de proteases cisteínicas. Em plantas, as fitocistatinas, constituem uma família independente, caracterizada pela presença do motivo conservado LARFAV. Elas podem estar envolvidas em uma grande variedade de processos fisiológicos, desde o controle da proteólise endógena em órgãos reprodutivos e vegetativos, até a inibição de proteases extracelulares de herbívoros, parasitas e patógenos. Algumas fitocistatinas possuem uma extensão carboxi-terminal em sua sequência, com um motivo consenso SNSL importante para a inibição de legumaínas. Em arroz, existem doze genes distintos de fitocistatinas, sendo a fitocistatina XII (OcXII) a única com um domínio extra carboxi-terminal. Considera-se esta extensão extremamente importante, pois permitiria a atuação bifuncional deste inibidor de proteinase, simultaneamente inibindo dois tipos de proteases, papaínas e legumaínas. O objetivo principal que norteou o desenvolvimento deste trabalho foi identificar as doze fitocistatinas de arroz (Oryza sativa), caracterizando, principalmente, o gene da OcXII, de forma a analisar as prováveis implicações funcionais deste gene na planta. A caracterização da expressão dos doze genes codificadores das fitocistatinas revelou que os genes comumente mais expressos são OcI, OcIII e OcXII, sendo que OcXII destaca-se nas plantas em estádio final de maturação das sementes, em tecidos específicos de endosperma e células em cultura. Para germinação e crescimento de plântulas, é necessária uma redução da expressão de OcXII. O padrão evolutivo das fitocistatinas, em diversas plantas, sugere uma origem comum para estes genes, seguida de divergências e duplicações específicas em cada espécie. A OcXII é mantida em um grupo monofilético com as demais fitocistatinas com extensão C-terminal. Nos estudos funcionais sobre a fitocistatina XII de arroz, nove linhagens de plantas RNAi para o gene OcXII foram obtidas via transformação de calos de arroz (ssp. japonica, cv. Nipponbare). Quatro destas linhagens apresentaram nível de pelo menos 90% de silenciamento de OcXII, sem alteração na expressão gênica das demais fitocistatinas e legumaínas. Duas destas linhagens tiveram alterações fenotípicas com redução da viabilidade das sementes geradas. O silenciamento de OcXII e expressão de demais fitocistatinas manteve-se inalterado na geração T1, enquanto as legumaínas 1 e 3 sofreram alterações em pelo menos uma das linhagens. A transformação de plantas para estudos de localização celular com o promotor do gene OcXII, resultou em quatro linhagens transformadas, sendo que em uma delas a expressão do gene repórter gus, controlado pelo promotor OcXII, foi significativamente detectada nos calos em vias de regeneração de plantas. Também, pode ser verificado que a OcXII responde ao tratamento com ABA (ácido abscísico), tendo um aumento de expressão significativo após 4 horas, tanto em tecidos de folha quanto de raiz. Desta forma, a fitocistatina XII é um dos genes de fitocistatinas mais expressos durante todo o desenvolvimento das plantas de arroz, sendo o único gene com provável capacidade de inibir proteases cisteínicas do tipo legumaínas.

Cystatins are cysteine proteases competitive inhibitors. Phytocystatins (PhyCys), in plants, constitute an independent family due to the presence of the LARFAV conserved domain. PhyCys are involved in a wide variety of physiological processes, since the control of the endogenous proteolysis in vegetative and reproductive organs, by inhibition of extracellular proteases from herbivores, pathogens and parasites. Some phytocystatins have an extension in their carboxy terminal sequence with a SNSL consensus domain, important for inhibiting legumains. In rice, there are twelve distinct phytocystatins genes and the phytocystatin XII (OcXII) are the only one with a carboxy-terminal additional domain. This extension would be extremely important, allowing the bifunctional performance of this proteinase inhibitor, simultaneously inhibiting two types of proteases: papains and legumains. A main goal of this work is to identify the twelve phytocystatins in rice (Oryza sativa), focusing at the OcXII gene in order to analyze the functional implications of this gene in the hole plant. Characterization of the gene expression pattern of the twelve phytocystatins revealed that the genes more ubiquously expressed are OCI, OcIII and OcXII. OcXII stands out in plants in final stage of seed maturation, in endosperm specific tissues and in culture cells. For germination and seedling growth OcXII undergoes a reduction in its genic expression. The phytocystatins evolution patterns in various plants, suggests a common origin for these genes, followed by divergences and duplications, specific to each species. The OcXII, is kept in a monophyletic group with all the other phytocystatins with C-terminal extension. In the functional studies on phytocystatin XII from rice, nine lines of RNAi plants were obtained by transformation of rice’s callus (japonica ssp. cv. Nipponbare). Four of these strains had low levels of OcXII mRNA, revealing that this gene were at least 90% silenced, any changes in gene expression for other phytocystatins or legumains were detected. Two of these transgenic lines showed phenotypic changes with reduced seed viability. The OcXII gene silencing and other phytocystatins expression remained unchanged in the T1 generation, while the first and third legumains varied in at least one of the strains. The plants transformation, for cellular localization studies with OcXII gene promoter resulted in four transgenic strains, and in one of them expression of the gus reporter gene, controlled by the promoter OcXII, was significantly detected in the calli undergoing the plant regeneration process. Also, it can be noticed that the OcXII gene expression responds to the treatment with ABA (abscisic acid), with a significant increase, in both tissues as leaf root, after 4 hours of treatment. Thus, phytocystatin XII is one of the most expressed genes troughout the development of rice plants, being the only gene with the probable ability to inhibit cysteine proteases of legumain type, in addition to papain proteases.