Desenvolvimento de técnicas de RT-PCR para seqënciamento do gene da hemaglutinina-neuraminidase (HN) e detecção do vírus Parainfluenza bovino tipo 3

Abstract

Existem diversos trabalhos publicados sobre a utilização de diferentes métodos imunológicos para diagnosticar infecções do trato respiratório causadas por vírus parainfluenza bovino tipo 3 (bPIV-3). Entretanto, é escassa a literatura sobre a utilização da técnica de isolamento viral. Até o presente momento não havia sido relatada a utilização da Transcrição Reversa - Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR), na detecção de bPIV-3. O objetivo deste estudo foi contribuir para uma melhor caracterização dos bPIV-3 através do desenvolvimento de técnicas de RTPCR para a sua detecção. Utilizando-se uma amostra referência de bPIV-3 (SF-4) e uma amostra de bPIV-3 isolada no Rio Grande do Sul (amostra DIO) foram desenvolvidas técnicas de RT-PCR para a amplificação de diferentes regiões do gene da hemaglutinina-neuraminidase (HN). Após seqüenciamento parcial do gene HN e alinhamento das seqüências da amostra DIO, os resultados revelaram homologia de 99% em relação à amostra referência, 98% a 91% quando comparada com outras amostras de bPIV-3 previamente publicadas na rede e 79% a 80% quando comparada com as amostras de hPIV-3. Foi desenvolvida, também, uma técnica de RT-PCR para amplificação de parte do gene da HN do bPIV-3 e do hPIV-3. Nos experimentos de otimização, a técnica de RT-PCR, comparada com o isolamento viral, apresentou sensibilidade de 140 DICC50, boa especificidade e reprodutibilidade. Os resultados, após seqüenciamento da amostra de vírus bPIV-3 isolada no RS, apresentaram, grande homologia com os das amostras de bPIV-3 comparadas, especialmente a amostra referência. Os dados obtidos neste estudo mostraram que a RT-PCR desenvolvida para a detecção de PIV-3 foi capaz de amplificar um fragmento de 1009 bp do gene da HN de amostras de PIV-3 isoladas de bovinos e humanos, possibilitando a sua utilização em diagnóstico e em estudos epidemiológicos.

There are several published studies on the application of different immunological methods for diagnosis of respiratory infections caused by bovine type 3 Parainfluenza virus (bPIV-3). However, the literature on viral isolation procedure is very scarce. At present there is no report about the utilization of reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for bPIV-3 detection. The aim of this study was to contribute to a better caracterization of bovine type 3 Parainfluenza virus by developing RT-PCR techniques to its detection. A reference sample (SF-4) and a sample of bPIV-3 isolated in Rio Grande do Sul (DIO sample) were used to develop RT-PCR techniques by amplification of different regions of hemagglutinin-neuraminidase gene (HN). After HN gene partial sequencing of DIO sample and sequence alignment, the results revealed 99% homology when compared to reference sample, 98% the 91% homology in relation to bPIV-3 samples previously published and 79% the 80% if compared to hPIV-3 samples. It was also developed a RT-PCR for amplification of a part of bPIV-3 and hPIV-3 NH gene. In optimization experiments, compared to viral isolation procedure, the RTPCR displayed a sensitivity of 140 DICC50, good specificity and reproductibility. Results after sequencing of bPIV-3 sample isolated in RS displayed strong homology with those of bPIV-3 tested samples, specially the reference sample. Data obtained in this study showed that the RT-PCR technique developed for PIV- 3 detection was able to amplify an 1009 bp HN gene fragment of bovine and human PIV-3 samples which enables its utilization in diagnostic and epidemiological studies.