UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DE SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS BIOLÓGICAS: FISIOLOGIA Diabetes e obesidade ativam vias pró-inflamatórias associadas com a progressão da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica: Estudo translacional Fábio Cangeri Di Naso Porto Alegre – RS, 2013. UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DE SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIENCIAS BIOLÓGICAS: FISIOLOGIA Diabetes e obesidade ativam vias pró-inflamatórias associadas com a progressão da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica: Estudo translacional Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul Orientadora: Profa. Dra. Norma Anair Possa Marroni Porto Alegre – RS, 2013. Isto sabemos, todas as coisas estão ligadas como o sangue que une uma família. Tudo o que acontece com a Terra, acontece com os filhos e filhas da Terra. O homem não tece a teia da vida; ele é apenas um fio. Tudo o que faz à teia, ele faz a si mesmo. TED PERRY, inspirado no Chefe Seatle AGRADECIMENTOS À minha esposa Juliana Saraiva Pereira, meu principal incentivo e exemplo de companheira, amiga e mulher, dedico este trabalho. Ao meu pai e maior mestre, Basílio Di Naso, que, apesar de ter passado pouco tempo comigo, conseguiu me ensinar os valores essenciais da vida. À minha mãe, Rosmary Cangeri Di Naso, e a meu irmão, Bruno Cangeri Di Naso, pelo carinho de terem sempre me ajudado e me incentivado a continuar batalhando. Aos meus colegas de Laboratório de Hepatologia Experimental e do Laboratório Fisiologia Celular, sem o auxilio dos quais não teria iniciado nem finalizado esta pesquisa, agradeço muito pelo companheirismo e auxílio no decorrer do trabalho. Aos meus mestres e amigos, Alexandre Simões Dias, Adriane Dal Bosco, Henrique Sarubi Fillmann e Paulo Ivo Homem de Bittencourt, que me ensinaram valores maiores do que a ciência e que, acreditando em mim, me ajudaram muito, agradeço os ensinamentos essenciais à minha formação. À querida professora e orientadora, Norma Possa Marroni, muito obrigado pela oportunidade proporcionada. Agradeço os incentivos, as críticas e, acima de tudo, o carinho demonstrado por mim e pelos demais alunos. LISTA DE ABREVIATURAS α – alfa β – beta γ – gama L – microlitro mol – micromolar ADA – American Diabetes Association AGE – produtos finais de glicação avançada ALT - alanina aminotransferase AST - aspartato aminotransferase ° C – graus Celsius CAT – enzima catalase Cdc42 - ciclo de divisão celular 42 cm – centímetros CO – controle CO+AG – controle + COX-2 – Ciclo-oxigenase - 2 Aminoguanidina CML – n(carboximetil)lisina CuZn-SOD – superóxido dismutase cobre-zinco DAG - diacilglicerol DM – Diabetes mellitus DM II - Diabetes mellitus tipo II DNA – ácido desoxirribonucléico DHGNA – Doença Hepática Gordurosa Não Alcóolica DP – desvio padrão EHNA – esteatohepatite não alcoólica ERKs - cinase reguladora de sinal extracelular ERN- espécies reativas de oxigênio ERO – espécies reativas de oxigênio EDTA – ácido etinodiaminotetracético eNOS- óxido nítrico sintase endotelial Fe – Ferro g – gramas GFAT - glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase GPx—enzima glutationa peroxidase GRd- enzima glutationa redutase GSH – glutationa reduzida GSSG – glutationa oxidada H+ - íons hidrogênio H2O – água H2O2- peróxido de hidrogênio HAS – hipertensão arterial sistêmica HGT- hemoglicoteste HSP- Proteína de choque térmico HSF – Fator de transcrição das proteínas de choque térmico ICAM-1 - molécula de adesão intercelular-1 i.p. – intraperitoneal IL- interleucina IMC – índice de massa corpórea iNOS- óxido nítrico sintase induzível IKK - inibidor do κB cinase KCl- cloreto de potássio KDa- kilodaltons Km – constante de Michaelis Kg- kilogramas LPO- lipoperoxidação MAP - proteína de ativação mitogênica MAPK - proteína cinase de ativação mitogênica mg- miligramas nmol- nanomol Mn-SOD- enzima superóxido dismutase manganês Na+/K+ ATPase – bomba sódio potássio ATPase dependente NaCl- cloreto de sódio NAD- nicotinamida adenina dinucleotídeo NADPH- forma reduzida do nicotinamida adenina dinucleotídeo NaHCO3- bicarbonato de sódio 4 NaOH – hidróxido de sódio NF-ĸB – fator de transcrição nuclear kappa B nm - nanômetro NO – óxido nítrico NO-2 – nitritos NO-3 – nitratos NOS – enzima óxido nítrico sintase 1 O2 – oxigênio singlet PGE2 – prostaglandina E2PBS – tampão salina-sulfato PMSF – fluoreto de fenil metilsulfonila PKA – proteína cinase A PKC – proteína cinase C pmoles – picomoles PLA2 – fosfolipase A2 RAGE – receptor dos produtos finais de glicação avançada RE – retículo endoplasmático ROOH – hidroperóxido alquil rpm – rotações por minuto SDS – solução de dodecil sulfato de sódio SH - esteatohepatite SOD – enzima superóxido dismutase ST - esteatose STZ – estreptozotocina O.- - ânion radical superóxido . OH – radical hidroxila OMS – Organização Mundial da Saúde ONOO.- - peroxinitrito OPT – optaldeído PAI-1 - inibidor do ativador de plasminogênio TBARS – substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico TBE – tris-ácidoclórico EDTA t-BOOH – hidroperóxido de tertbutila TCA – ácido tricloroacético TE – tampão tris EDTA TEMED – tertametil-etilclorodimida TRIS – pó trisma, tampão de extração TGF β - fator de crescimento transformante β TNF-α – fator de necrose tumoral alfa U/mL – unidade por milimolar V- volts VCAM-1 - molécula de adesão celular vascular-1 VEGF - fator de crescimento do endotélio vascular 5 SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................................. 1 LISTA DE FIGURAS .......................................................................................... 7 RESUMO............................................................................................................ 8 ABSTRACT ...................................................................................................... 10 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 12 1 – REFERENCIAL TEÓRICO ......................................................................... 14 1.1 Diabetes Mellitus......................................................................................................... 14 1.2 Obesidade ................................................................................................................... 19 1.3 Estresse oxidativo e defesas antioxidantes .............................................................. 21 1.4 Diabetes Mellitus e estresse oxidativo....................................................................... 26 1.5 Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica .............................................................. 30 1.6 Vias de sinalização pró-inflamatórias ativadas na obesidade .................................. 35 1.7 Ativação da JNK e proteínas de choque térmico ...................................................... 39 2. OBJETIVOS DO ESTUDO ........................................................................... 44 2.1 Objetivo geral .............................................................................................................. 44 2.2 Objetivos específicos ................................................................................................. 44 2.2.1 Artigo 1: ................................................................................................................. 44 2.2.2 Artigo 2: ................................................................................................................. 44 3- MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................... 46 3.1 Artigo 1 ........................................................................................................................ 46 3.1.1 Delineamento do estudo: ....................................................................................... 46 3.1.2 Animais e protocolo experimental .......................................................................... 46 3.1.3 Preparo dos homogeneizados de fígado................................................................. 47 3.1.4 Dosagem de proteínas ............................................................................................ 48 3.1.5 Medida das Substâncias que Reagem ao Acido Tiobarbitúrico (TBARS) ................... 48 3.1.6 Western blot .......................................................................................................... 49 3.1.7 Análise Estatística ................................................................................................... 50 3.2 Artigo 2 ........................................................................................................................ 51 3.2.1 Delineamento do estudo: ....................................................................................... 51 3.2.2 Pacientes ................................................................................................................ 51 3.2.3 Estudo histológico .................................................................................................. 52 3.2.4 Detecção das HSPs através da imunofluorescência ................................................. 53 3.2.5 Análises bioquímicas de estresse oxidativo ............................................................. 54 3.2.6 Atividade da Superóxido Dismutase (SOD) .............................................................. 54 3.2.7 Western blot .......................................................................................................... 55 3.2.8 Análise Estatística ................................................................................................... 56 6 4. RESULTADOS ............................................................................................. 57 4.1 Artigo 1 ........................................................................................................................ 57 4.2 Artigo 2 ........................................................................................................................ 62 5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 97 PERSPECTIVAS FUTURAS .......................................................................... 109 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 110 ANEXO I......................................................................................................... 124 ANEXO II........................................................................................................ 125 7 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Efeitos dos Produtos Finais da Glicação Avançada .......................... 16 Figura 2: Mecanismo de defesa enzimática contra as ERO 48. ........................ 24 Figura 3: As principais vias de aumento na geração do anion radical superóxido estão relacionadas com as vias que levam as complicações crônicas do DM............................................................................................................. 27 Figura 4: Esquema da progressão da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica.. .................................................................................................. 31 Figura 5: Fisiopatologia da da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica:. ... 32 Figura 6: Aspectos pró-inflamatórios relacionados com a obesidade e resistência insulínica.. ............................................................................... 36 Figura 7: Obesidade e hiperlipidemia aumentam níveis plasmáticos de ácidos graxos livres e ativam JNK nos hepatócitos. ............................................. 40 Figura 8: Expressão das proteínas de choque térmico (HSPs). ....................... 41 8 RESUMO A Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (DHGNA) é uma doença de alta incidência e difícil diagnóstico relacionada principalmente com a obesidade e o diabetes. Pode se manifestar desde uma forma de estatose simples progredindo para a esteatohepatite, caracterizada pela presença de infiltrado inflamatório e até mesmo para formas mais graves, como cirrose e carcinoma hepatocelular. Apesar do envolvimento da obesidade e do diabetes no desenvolvimento da DHGNA, ainda não estão claros os fatores que contribuem para a progressão da doença. O estudo experimental tem como objetivo avaliar o estresse oxidativo e nitrosativo hepático em um modelo experimental de diabetes. O estudo clínico tem como objetivo avaliar marcadores de estresse oxidativo e o envolvimento das proteínas de choque térmico na progressão da doença hepática gordurosa não alcoólica. Foi utilizado um modelo de diabetes experimental em ratos wistar (21) induzidos através de estreptozotocina. Foi avaliado o estresse oxidativo hepático através da medida das substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e o estresse nitrosativo hepático através da expressão da iNOS e nitrotirosina pelo método Western Blot. Também foi avaliada a expressão da p65 representando a ativação do NFƙB hepático no modelo. No estudo em humanos, foram avaliados pacientes com obesidade grave (95) e diagnóstico de Doença Hepática Gordurosa não Alcoólica diagnosticada através de biópsia hepática no trans-operatório da cirurgia bariátrica. Os pacientes foram divididos nos grupos esteatose (ST), esteatohepatite (SH) e esteatohepatite + fibrose (SH+F) através de análise da biópsia por um patologista cegado. Foram avaliados marcadores metabólicos e antropométricos, assim como provas de função hepática. O estresse oxidativo sistêmico foi avaliado através do TBARS e atividade da SOD plasmática. A expressão das proteínas HSP70, HSF-1, JNK1, JNK2, p-JNK1 e p-JNK 2 foram avaliadas no fígado e tecido adiposo dos pacientes através do método Western Blot. A expressão e distribuição da HSF- 9 1 e HSP70 também foram avaliadas no tecido hepático através da imunofluorescência. No modelo experimental de diabetes, foi observado um aumento da lipoperoxidação e da expressão da iNOS, nitrotirosina e p65 no fígado do grupo de animais diabéticos. No estudo clínico, foi observado um aumento significativo do estresse oxidativo sistêmico dos pacientes e na resistência insulínica do grupo SH e SH+F quando comparados ao grupo ST. A expressão da HSP70 e HSF-1 foi menor com a progressão da doença enquanto a ativação da JNK foi maior. A obesidade e o diabetes promovem aumento do estresse oxidativo hepático e deprimem a via anti-inflamatória HSP70 contribuindo para a progressão da DHGNA. 10 ABSTRACT Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a disease of high incidence and difficult diagnosis mainly related to obesity and diabetes. Can manifest from a form of simple steatosis to steatohepatitis, characterized by the presence of inflammatory infiltrate, and even more severe forms, such as cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Despite the involvement of obesity and diabetes in the development of NAFLD, are still not clear the factors that contribute to disease progression. The experimental study aims to evaluate the hepatic oxidative and nitrosative stress in an experimental model of diabetes. The clinical study aims to evaluate oxidative stress markers and the involvement of heat shock proteins in the progression of nonalcoholic fatty liver disease. We used a model of experimental diabetes in Wistar rats (21) induced by streptozotocin. We evaluated the hepatic oxidative stress by measuring substances that react with thiobarbituric acid TBARS and nitrosative stress through the hepatic expression of iNOS and nitrotyrosine by western blot method. We also analyzed the expression of p65 representing NFƙB activation. In the clinical study, was evaluated patients with severe obesity (95) and diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease diagnosed by liver biopsy obtained during bariatric surgery. Patients were divided into steatosis group (ST), steatohepatitis (SH) and steatohepatitis and fibrosis (SH + F) through analysis of biopsy by a blinded pathologist. Were evaluated metabolic markers, anthropometric data and liver function tests. The systemic oxidative stress was evaluated by TBARS and SOD activity in plasma. The expression of proteins HSP70 , HSF-1, JNK1, JNK1, p-JNK1 and p-JNK2 were evaluated in the liver and adipose tissue of patients using the western blot method. The expression and distribution of HSF-1 and HSP70 were also assessed in the liver by immunofluorescence. In experimental diabetes, we observed an increase in lipid peroxidation and expression of iNOS, nitrotyrosine and p65 in the liver of the group of diabetic animals. In the clinical study, there was a significant increase in 11 systemic oxidative stress of patients and insulin resistance in the group SH and SH + F when compared with ST. The expression of HSP70 and HSF-1 was lower with the progression of the disease while JNK activation was greater. Obesity and diabetes promote increased hepatic oxidative stress and depress the anti-inflammatory HSP70 pathway that contributes to the progression of NAFLD. 12 INTRODUÇÃO A prevalência de obesidade aumenta de forma alarmante nos últimos anos no ocidente, tanto nos países desenvolvidos como nos em desenvolvimento, estando relacionada principalmente ao estilo de vida sedentário e a hábitos alimentares inapropriados 1. No Brasil, o número de indivíduos obesos cresceu significativamente nos últimos anos. Segundo dados do Ministério da Saúde (MS), quase metade da população adulta (48,1%) está acima do peso e 15% são obesos. Se for considerada somente a população masculina, mais da metade dos homens está acima do peso (52,1%). Entre as mulheres, a porcentagem de sobrepeso é de 44,3%. Associado a elevada prevalência de sobrepeso e obesidade ,o coeficiente de prevalência padronizado de diabetes elevou-se de 2,9% em 1998 para 4,3% em 20092. Com isso, várias co-morbidades associadas à obesidade também têm apresentado aumento na sua incidência, dentre elas a doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) 3, 4 . A DHGNA é uma condição clínico- patológica que abrange a esteatose, a esteatohepatite e formas mais graves da doença hepática como cirrose e carcinoma hepatocelular 5. A DHGNA compõe a síndrome metabólica, juntamente a hipertrigliceridemia, hipertensão arterial, obesidade central, hiperglicemia e diminuição de lipoproteínas de alta densidade 6-8 . Obesidade, diabetes mellitus tipo II (DM II) e dislipidemia são as co-morbidades mais comumente associadas à DHGNA, doença que afeta qualquer faixa etária ou grupo racial. Em pacientes com DHGNA, a prevalência da obesidade relatada em vários estudos é de 30 a 100%, DM II de 10-75% e dislipidemia de 20 a 92% 9. Pacientes obesos têm um aumento de 4,6 vezes na prevalência de DHGNA, quando comparados a indivíduos não obesos saudáveis. A resistência à insulina parece desempenhar um papel fundamental na patogênese destas condições, e por isso tem sido sugerido que a DHGNA (esteatose e esteato-hepatite) seja considerada como mais um critério no diagnóstico da síndrome metabólica 8. 13 Apesar do envolvimento da obesidade e do diabetes no desenvolvimento da DHGNA, ainda não estão claros os fatores que contribuem para a progressão da doença. O tecido adiposo atuando como um sinalizador inflamatório e o estresse oxidativo atualmente aparecem como os principais responsáveis para a progressão da doença da esteatose hepática para a forma inflamatória da doença, a esteatohepatite 10. No entanto, estes marcadores demonstraram evidência na progressão da doença em estudos experimentais e in vitro, e ainda possuem pouca validade clínica reconhecida. Pesquisas translacionais pré-clinicas são frequentemente estabelecidas através do uso de modelos animais, culturas de tecidos, amostras de células humanas e animais ou através de sistemas experimentais tais como o estudo de moléculas biológicas, incluindo o DNA, RNA e as proteínas. O segundo domínio translacional reúne os resultados dos estudos básicos e os aplica na prática clínica, na tentativa de melhorar a saúde da população e facilitar a adoção das melhores práticas pela comunidade. Esta relação entre a pesquisa experimental e a pesquisa clínica é fundamental para que descobertas recentes já se tornem procedimentos aplicados, reduzindo o tempo destinado para que os primeiros benefícios para sociedade sejam estabelecidos. Portanto, a presente tese de defesa de doutorado tem o objetivo de analisar marcadores moleculares hepáticos em um modelo experimental de diabetes mellitus e em pacientes com DHGNA, além de relacionar estes marcadores com a progressão da doença. 14 1 – REFERENCIAL TEÓRICO 1.1 Diabetes Mellitus O Diabetes Mellitus (DM) é um grupo de desordens metabólicas que apresenta uma característica em comum, a hiperglicemia. A hiperglicemia no diabetes ocorre devido a defeitos na secreção e na ação da insulina. Em virtude do crescimento e envelhecimento populacional, urbanização, aumento da prevalência de obesidade e inatividade física cresce cada vez mais o número de diabéticos em todo o mundo 11 . A classificação clássica do diabetes mellitus está fundamentada nos sinais clínicos apresentados pelos pacientes que são enquadrados, na maioria dos casos, em duas grandes categorias 12. O diabetes do tipo 1 (DM I) é caracterizado por uma deficiência absoluta de insulina causada pela destruição das células β-pancreáticas relacionada com múltiplas predisposições genéticas e fatores ambientais, ou de etiologias desconhecidas, denominada diabetes idiopática 13 . O diabetes do tipo 2 (DM II) é causado por uma combinação de 14 resistência periférica à insulina e uma resposta secretora inadequada das células β. Aproximadamente 80% a 90% apresentam diabetes do tipo 2 . A nova classificação do DM foi redefinida em publicação da American Diabetes Association (ADA) e da Organização Mundial da Saúde (OMS) de 2006. As últimas diretrizes nacionais e internacionais recomendam a classificação do DM em quatro categorias: DM tipo 1 (DM I), DM tipo 2 (DM II), Outros tipos e Diabete Gestacional15. O DM não-controlado apresenta conseqüências agudas como a hiperglicemia com cetoacidose ou a síndrome hiperosmolar não-cetótica. Os sintomas característicos de hiperglicemia são poliúria, polidipsia, perda de peso corporal, muitas vezes com hiperfagia e visão turva. A hiperglicemia crônica pode acarretar em retinopatia, nefropatia, neuropatia periférica e neuropatia 15 autonômica incidência 14 . Adicionalmente, entre pacientes com diabetes há elevada aterosclerose, doença arterial periférica e doença de cerebrovascular 15. A atual pandemia de DM tem estimulado a realização de pesquisas para elucidar a intrincada fisiopatologia da doença, a fim de que haja melhora na detecção, na prevenção e no tratamento das complicações associadas. Existem quatro hipóteses principais que explicam como a hiperglicemia resulta nas complicações diabéticas. Estas hipóteses são o aumento da formação de produtos finais da glicação avançada (do inglês, Advanced Glycated EndProducts AGEs), o aumento no fluxo da via dos polióis, a ativação de isoformas da proteino cinase C (PKC) e o aumento no fluxo da via da hexosamina 16 .A hiperglicemia também é a causa principal do aumento na geração do ânion radical superóxido e o estresse oxidativo é aceito como principal fator desencadeante no desenvolvimento das complicações crônicas do DM 16 . Apesar de complicações do DM apresentarem origem multifatorial, o processo bioquímico de glicação avançada é acelerado devido à hiperglicemia crônica e ao estresse oxidativo. A glicação avançada envolve a geração de um grupo heterogêneo de substâncias químicas conhecidas como produtos finais da glicação avançada (AGEs). A geração desses produtos resulta de reação não enzimática da glicose com proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos 17. A maior parte dos AGEs in vivo são formados a partir de níveis elevados de intermediários reativos dos grupos carbonilas conhecidos como α-dicarbonilas ou oxoaldeídos. Uma das melhores caracterizações químicas dos AGEs em humanos inclui a pentosidina e a N(carboximetil)lisina (CML) 18 . Os AGEs geralmente se acumulam no meio intracelular e ativam vias de sinalização celular ou modificam a função de proteínas (Figura 1). Seus efeitos no diabetes podem ser classificados como independentes ou dependentes de receptores, podendo atuar de maneira intracelular ou através de ligação com a superfície celular por intermédio de receptores, como o receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE) 19. A glicação avançada ocorre após período prolongado e afeta proteínas de longa vida. Os componentes estruturais da matriz do tecido conjuntivo e, em particular, os componentes da membrana basal, como o colágeno do tipo IV, são os alvos principais. Outras proteínas de vida longa também são afetadas, 16 incluindo a mielina, a tubulina, o inibidor do ativador do plasminogênio 1 (PAI-1) e o fibrinogênio 20 . As proteínas da matriz extracelular são suscetíveis a 18 alterações dos AGEs, devido às suas baixas taxas de renovação . A formação de ligações inter e intramoleculares com o colágeno, resultantes do processo de glicação, leva a alterações estruturais. Pode ocorrer aumento de rigidez, aumento da resistência à digestão proteolítica, aumento de proteínas da matriz extracelular (incluindo a fibronectina, colágeno tipo III, IV e VI e laminina) e up-regulation de citocinas como o TGF-β 21-23. Figura 1: Efeitos dos Produtos Finais da Glicação Avançada Legenda: Cdc42 Ciclo de divisão celular 42, MAP proteína de ativação mitogênica, ERO espécies reativas de oxigênio, ICAM-1 molécula de adesão intercelular-1, VCAM-1 molécula de adesão celular vascular-1, VEGF fator de crescimento do endotélio vascular, IL-6 interleucina_ 6, TNF- fator de necrose tumoral-, ONOO peroxinitrito, RAGE receptor dos produtos finais de glicação avançada, eNOS óxido nítrico sintase endotelial, NADPH nicotinamida adenina dinuceotídeo fosfato reduzida16. Os efeitos receptor-dependentes dos AGEs são mediados via interação com diversas proteínas que se demonstram ligantes com essas estruturas complexas. O receptor mais estudado é o RAGE, no entanto, outras proteínas ligantes já foram estudadas. O receptor dos produtos finais de glicação 17 avançada (RAGE) é um membro da superfamília das imunoglobulinas da superfície celular. Ao interagir com seu receptor, os AGEs ativam a via de transdução de sinais secundários, como a proteína cinase C (PKC). O alvo chave da sinalização dos AGEs é o NF-κB, que é translocado para o núcleo, ativa a transcrição de numerosas proteínas celulares, incluindo as moléculas de adesão celular-1 (ICAM-1), E-selectina, endotelina-1, fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e citocinas pró-inflamatórias 24-26 . A região 27 promotora do receptor contém elementos de ligação funcional para o NF-κB , e uma das consequências de sua translocação é a própria up-regulation do RAGE. Esse receptor pode ligar-se a outros peptídeos e proteínas não glicosilados, incluindo a isoforma S100 e a anfoterina, que é um ligante implicado na lesão progressiva vascular. Nas células endoteliais, a interação dos AGE-RAGE pode provocar distúrbios na função celular, além de vias envolvendo NAD(P)H oxidase, geradoras de espécies reativas de oxigênio, e proteína cinases de ativação mitogênica (MAPKs) 28 . O RAGE solúvel endógeno (sRAGE) é uma porção variante do receptor completo e é detetável no plasma. O sRAGE não possui o terminal COOH nem domínios transmembrana, pode competir com outros ligantes e prevenir sua interação com a superfície celular do receptor, bloqueando a sinalização celular. O potencial terapêutico do RAGE solúvel foi observado em modelos experimentais de nefropatia e aterosclerose em ratos diabéticos 29, 30. Em pacientes com diabetes do tipo 2, que não apresentam complicações micro ou macrovasculares, os níveis circulantes de sRAGE são significativamente menores do que em sujeitos sem a doença. Além disso, correlacionam-se inversamente com marcadores de estresse oxidativo. Esses achados sugerem que os níveis de sRAGE podem servir como biomarcador e protetor endógeno nas complicações decorrentes ao estresse oxidativo no DM e em outras doenças 31. Outra via importante induzida pelo aumento da concentração de glicose intracelular é a via dos polióis. Esta via apresenta a enzima aldose redutase como elemento chave em suas reações. A enzima possui baixa afinidade com glicose (alto Km), e concentrações normais de glicose representam baixa atividade desta via. A aldose redutase normalmente tem a função de reduzir aldeídos tóxicos na célula em alcoóis inativos, porém, quando a concentração 18 de glicose aumenta (como no diabetes), ela também reduz a molécula a sorbitol, que posteriormente é oxidado à frutose. Neste processo, a enzima aldose redutase consome o cofator NADPH, que é essencial no processo de regeneração do antioxidante glutationa reduzida. Por reduzir a quantidade de antioxidante intracelular, a via dos polióis aumenta a suscetibilidade ao estresse oxidativo. Além de o aumento no fluxo desta via contribuir para redução das defesas antioxidantes celulares, outras alterações na homeostase celular são resultantes do acúmulo de sorbitol, incluem o estresse osmótico, pelo fato de sorbitol apresentar baixa difusibilidade e redução na atividade da bomba (Na+-K+) ATPase. Estudos experimentais demonstraram redução na disfunção da condução nervosa periférica de cães diabéticos, quando tratados com inibidores da aldose redutase 32 . A hiperglicemia também aumenta a síntese de diacilglicerol (DAG) no meio intracelular, o que contribui na ativação crítica de cofatores para a forma clássica da PKC (α, β e γ). Esse aumento pode resultar da hidrólise de fosfatidilinositídeos, do metabolismo da fosfatidilcolina através da fosfolipase-C ou da síntese de novo de DAG, a partir de intermediários glicolíticos. Quando a PKC é ativada pela hiperglicemia ocorre uma variedade de efeitos na expressão de genes 33 . Na ativação da PKC, a expressão da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) é diminuída, enquanto as expressões da endotelina-1, TGF-β e PAI-1 aumentam, representando alterações no fluxo sanguíneo. O tratamento com um inibidor específico para PKC β reduziu significantemente sua ativação na retina e no glomérulo renal de animais diabéticos, e isso ocasionou melhoras funcionais nessas estruturas 34. 19 1.2 Obesidade A epidemia de obesidade é uma indesejada consequência dos avanços econômicos, sociais e tecnológicos conquistados durante as últimas décadas. O fornecimento de alimentos de baixo custo, abundantes e palatáveis resulta em um consumo diário com alta densidade calórica. Além disto, os avanços tecnológicos reduziram em muito a quantidade de atividade física e o gasto energético nas atividades de vida diária 1. As contribuições dos fatores genéticos e ambientais para a etiologia da obesidade têm sido avaliadas em vários estudos 35 . Os estudos apresentam que de 30% a 40% da variância no índice de massa corpórea (IMC) pode ser atribuída à genética e 60% de 70% ao meio ambiente. A interação entre genética e ambiente também é importante 36 . Em uma dada população, algumas pessoas são geneticamente predispostas a desenvolver obesidade, mas este genótipo pode ser expresso apenas em condições ambientais com dietas ricas em gordura e sedentarismo. Nos Estados Unidos, bem como em outros países ocidentais, um maior número de pessoas são expostos a estas condições ambientais e, consequentemente, a porcentagem de pessoas expressando o genótipo da obesidade aumenta 35. No Brasil, o número de indivíduos obesos cresceu significativamente nos últimos anos. Segundo dados do Ministério da Saúde (MS), quase metade da população adulta (48,1%) está acima do peso e 15% são obesos. Se for considerada somente a população masculina, mais da metade dos homens está acima do peso (52,1%). Entre as mulheres, a porcentagem de sobrepeso é de 44,3%. Associado a elevada prevalência de sobrepeso e obesidade ,o coeficiente de prevalência padronizado de diabetes elevou-se de 2,9% em 1998 para 4,3% em 2009 2. A prevalência padronizada por gênero e idade de diabetes, tendo como 20 referência a população mundial de 2010 e as projeções para 2030 em diversos países do mundo, entre eles o Brasil indicam que entre 2010 e 2030, haverá um aumento de 69,0% no número de adultos, na faixa etária de 20-79 anos, com diabetes nos países em desenvolvimento; e um aumento de 20,0% nos países desenvolvidos. Em 2010, a prevalência estimada de diabetes, padronizada por gênero e idade e tendo como referência a população mundial, foi de 6,4% no Brasil. Essa prevalência foi menor do que aquela estimada para os Estados Unidos da América (10,3%), o Canadá (9,2%) e o México (10,8%); contudo, foi superior à estimada para o Japão (5,0%), a Argentina (5,7%) e o Chile (5,7%)37. O rápido aumento da prevalência da obesidade é um problema de saúde global. Suas complicações resultam em um aumento do risco de morte de 20% a 40% em indivíduos com excesso de peso, e de 2 a 3 vezes em indivíduos obesos em comparação com indivíduos sem sobrepeso, mesmo que a força de associação entre o índice de massa corporal e eventos de insuficiência cardíaca diminui com a idade 38 . A obesidade é um conhecido fator de risco para a Doença Hepática Gordurosa Não Alcóolica (esteatose hepática) 8, hipertensão, acidente vascular cerebral, doença da vesícula biliar, osteoartrite, apnéia obstrutiva do sono e outros problemas respiratórios, bem como algumas formas de câncer (mama, colorretal, endometrial e rim). O Diabetes e a obesidade estão interligados, a obesidade é conhecida por exacerbar o diabetes tipo 2 e mais de 60% dos diabéticos são obesos 39 . Estes dados justificam a realização de estudos com indução do diabetes experimental que relacionem o modelo com a doença em humanos. 21 1.3 Estresse oxidativo e defesas antioxidantes Para que o metabolismo celular ocorra, faz-se necessário o uso de energia derivada da oxidação dos nutrientes, a qual é dirigida para a formação de compostos fosfatados de alta energia, dentre os quais o mais importante é o adenosina trifosfato (ATP). Para a realização de exercícios, a energia é fornecida quimicamente pela hidrólise da molécula de ATP. As espécies reativas de oxigênio (ERO) formam-se principalmente durante a redução dessa molécula em água na cadeia de transporte de elétrons mitocondrial40. Nas membranas mitocondriais, estão situadas as proteínas transportadoras de elétrons, principalmente os citocromos, que reduzem uma molécula de oxigênio em água durante o processo da respiração celular. Essa redução requer quatro sucessivas transferências de um elétron cada uma. A teoria foi proposta por Michaelis (1946) e denominada de redução univalente. Dois dos intermediários das reações são chamados de radicais livres, sendo eles: o ânion superóxido (O2-) e o radical hidroxila (OH) 41, 42. A maior parte do oxigênio (aproximadamente 95%) recebe quatro elétrons de uma só vez, pelo sistema oxidativo citocromo-oxidase, redução tetravalente. Porém, em cerca de 5% dos casos, a redução é monovalente, ou seja, a molécula de oxigênio recebe apenas um elétron de cada vez, proporcionando a formação de intermediários reativos e tóxicos denominados espécies reativas de oxigênio (ERO) 43 . O termo radical livre (RL) é usado quando uma espécie química, que pode ser um átomo como o hidrogênio ou o cloro, um metal de transição ou uma molécula, possui um elétron não pareado no seu último orbital 44 . O elétron não pareado neste orbital confere alta reatividade à molécula, a qual apresenta forte tendência a adquirir um segundo elétron para este orbital. Essas espécies altamente reativas têm o potencial de oxidar moléculas biológicas, incluindo proteínas, lipídios e DNA. Quantidades aumentadas de 22 metabólitos oxidados dessas moléculas têm sido detectadas em pacientes com variedade significativa de doenças 45 . Quando um RL reage com um composto não radical, outro RL pode ser formado, induzindo, assim, reações em cadeia, como é o caso da lipoperoxidação (LPO). Dessa forma, podem ser produzidos efeitos biológicos distantes do sítio de geração do primeiro RL formado. As reações em cadeia têm uma série de etapas durante as quais se consome uma espécie intermediária, os reativos se convertem em produtos, e os intermediários são regenerados, permitindo que o ciclo recomece. São etapas do processo de LPO : iniciação, propagação e terminação 46 . A iniciação é o primeiro passo das reações em cadeia, é necessário que o RL ataque uma molécula orgânica, abstraindo um átomo de hidrogênio de um grupamento químico. Na LPO, o RL é geralmente o radical hidroxila, e o grupamento químico é um metileno pertencente a um ácido graxo poliinsaturado da membrana 47 . A retirada de um átomo de hidrogênio do grupamento metileno leva à formação de um radical centrado no carbono (-CH-), o qual tende a se estabilizar por um rearranjo molecular, formando um dieno conjugado. Este, por sua vez, ao se combinar com o oxigênio, produz o radical peroxil. . No estágio de propagação, os radicais peroxil são capazes de abstrair hidrogênio de outra molécula lipídica, ou seja, de um ácido graxo adjacente. O radical peroxil pode também se combinar com o átomo de hidrogênio que ele abstraiu, produzindo um lipídio hidroperóxido. Os lipídios hidroperóxidos se decompõem em reação catalisada por complexos de ferro e cobre, produzindo aldeídos como o malondialdeído, hidrocarbonetos voláteis (como o gás pentano) e outros produtos que podem ser detectados experimentalmente 42 42 . Sugeriu-se que as reações de degradação que ocorrem durante a LPO podem originar oxigênio singlet, acelerando esse processo . Na etapa de terminação, dois radicais peroxil reagiriam entre si formando um tetróxido instável que se decompõe dando origem ao oxigênio singlet (102) e carbonilas excitadas, que retornam ao seu estado fundamental emitindo quantas de luz visível. Além da perda da fluidez da membrana há também desarranjo dos receptores e potenciação da lise celular. O dano dos RL a enzimas que contêm 23 enxofre e outras proteínas culmina em sua inativação, ligações cruzadas e desnaturação 48. As ERO, quando formadas, ao reagirem com biomoléculas, causam diferentes tipos de danos biológicos que podem levar à morte celular. Os organismos aeróbios desenvolveram diferentes tipos de defesas antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas - prevenindo a formação de ERO, bem como, mecanismos para reparar os danos causados pelos mesmos. Antioxidante é qualquer substância que, quando presente em baixas concentrações, comparadas às de um substrato oxidável, retarda ou inibe significativamente a oxidação deste substrato - enzimático ou não enzimático 42 . A defesa do organismo contra as ERO atua na prevenção da formação delas, na interceptação dos radicais formados e no reparo das células danificadas. Os sistemas que previnem a formação de ERO são considerados biomoléculas ligantes de metais (Fe e Cu), os quelantes. A presença de proteínas quelantes é de vital importância aos seres vivos, pois previnem as células dos processos oxidativos catalisados por íons metálicos. Pigmentos especializados previnem a ação da radiação ultravioleta: a melanina e os carotenoides impedem a ação do oxigênio singlet. As enzimas que controlam os níveis de ERO são a glutationa peroxidase (GPx), a superóxido dismutase (SOD) e a catalase (CAT) (Figura 2) . A interceptação é a desativação das ERO, quando elas são destruídas de forma a impedir a oxidação posterior de outras moléculas. A desativação final de um composto radical consiste na formação de um outro produto não radical. O interceptador (antioxidante) mais eficiente deve combinar propriedades ótimas, as quais reagirão com RL iniciais, tais como radicais peroxil (ROO) e, posteriormente, interagir com compostos hidrossolúveis para a sua própria regeneração. Estes transferem a função radical para longe do sítio-alvo potencial, são chamados “scavengers” de RL. A combinação de uma substância com um RL leva à formação de um não radical ou um radical menos lesivo, como, por exemplo, tocoferóis e carotenóides. Substâncias que funcionam como “quenchers” de oxigênio singlet são aquelas que absorvem a energia de excitação e a liberam em forma de calor ou movimento. 24 Figura 2: Mecanismo de defesa enzimática contra as ERO 49 . A mais importante reação envolvendo o superóxido, a qual ocorre espontaneamente, é sua própria dismutação para H 2O2 e O2 49. Entretanto, na presença da enzima superóxido dismutase (SOD), a dismutação do superóxido pode ser aumentada intracelularmente em 10 4 vezes 50 . Existem várias formas de SOD. Uma, contendo manganês, é encontrada na matriz mitocondrial (MnSOD), e outra, contendo cobre e zinco, é encontrada no citosol (CuZn-SOD). Uma superóxido dismutase, contendo ferro, existe em algumas bactérias e plantas. Tem sido sugerido que os três diferentes tipos da enzima SOD apresentam papel fisiológico diferente. A enzima CAT decompõe o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio. A maioria das CAT possui um grupo heme (Fe3+-protoporfirina) e ligado a cada subunidade uma molécula de NADPH, que auxilia na estabilização da enzima. A enzima GPx é uma peroxidase que utiliza doadores de e - para reduzir o peróxido de hidrogênio em água. A mais importante peroxidase é a glutationa peroxidase que utiliza selênio (Se) no sítio catalítico e utiliza o tripeptídio tiólico glutationa (-glutamil-cisteil-glicina) (Glu-Cys-Gly) (GSH) como doador de elétron para a redução do peróxido de hidrogênio e de outros peróxidos orgânicos, tais como os lipoperóxidos provenientes da LPO, impedindo, assim, a fase de propagação deste processo. Durante o processo catalisado pela GPx, ocorre a oxidação da glutationa, formando-se uma ponte dissulfeto entre duas moléculas de GSH. Em células normais, ocorre a presença de enzimas acessórias. A glutationa 25 redutase (GR) utiliza elétrons do NADPH para a redução de pontes dissulfeto da GSSG e reestabelece os níveis intracelulares de GSH 51 . A distribuição das enzimas antioxidantes nas células está intimamente relacionada com as fontes de ERO e elas estão em maior quantidade em locais particularmente expostos as ERO, como nos compartimentos celulares ou no líquido extracelular 42. 26 1.4 Diabetes Mellitus e estresse oxidativo A hiperglicemia também ativa um mecanismo comum às quatro vias patogênicas anteriormente descritas que é o aumento na produção do ânion radical superóxido (O-.) pela cadeia de transporte de elétrons mitocondrial. O estresse oxidativo é aceito como fator chave na mediação do desenvolvimento e progressão do diabetes e de suas complicações (Figura 3) 57 52-56 . A mitocôndria é a principal fonte de ERO da célula que são gerados a partir de um pareamento imperfeito no transporte de elétrons . O piruvato derivado da glicolise é transportado para o interior da mitocôndria onde é oxidado nas reações existentes no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Os elétrons que derivam da oxidação de substratos são transportados por carreadores redox da cadeia respiratória (complexos I, III e IV) para o aceptor final de elétrons, o oxigênio molecular. O oxigênio é convertido em água a partir da redução tetravalente. No entanto, durante o metabolismo normal, formas reativas de oxigênio incompletas são produzidas, como o superóxido. Normalmente, 0,1% do consumo total de oxigênio gera as ERO e o fator primordial para este desvio é o estado redox da cadeia respiratória 58 . A hiperglicemia induz aumento nos doadores de elétrons (NADH e FADH2) aumentando o fluxo de elétrons na cadeia transportadora mitocondrial. Consequentemente, ocorre um aumento na relação ATP/ADP e uma hiperpolarização no potencial de membrana mitocondrial. Esta alta diferença de potencial eletroquímico gerada pelo gradiente de prótons leva a uma inibição parcial no complexo III do transporte de elétrons, resultando no acúmulo de elétrons na coenzima Q. Isto levaria a uma redução parcial de O2 e a geração do radical livre superóxido 59 . O aumento das espécies reativas de oxigênio pode ser prevenido por um inibidor do complexo II da cadeia de transporte de elétrons e pela enzima manganês superóxido dismutase 60 . A normalização dos níveis de espécies reativas de oxigênio pela ação destes dois agentes previne a ativação induzida 27 pela glicose da PKC, a formação de AGEs, o acúmulo de sorbitol e a ativação de NFĸB em células endoteliais aórticas bovinas expostas à hiperglicemia 60. Figura 3: Independente do tipo do DM, a hiperglicemia é a principal via patogênica. As principais vias de aumento na geração do anion radical superóxido estão relacionadas com as vias que levam as complicações crônicas do DM. AGE: Produtos Finais de Glicação Avançada, PKC: Proteína cinase C. A utilização de antioxidantes exógenos pode ser uma alternativa na terapêutica do DM. Estudos experimentais demonstram resultados favoráveis de melhora na atividade de enzimas antioxidantes e na redução do estresse oxidativo hepático após a utilização de antioxidantes 61-63 . Nosso grupo de pesquisa já demonstrou as alterações hepáticas em um modelo experimental de DM e o envolvimento de vias de transcrição nuclear redox-dependentes, como o fator de transcrição nuclear NF-κB. A hiperglicemia crônica estabelecida pelo modelo resultou na ativação do NF-κB, aumento da expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e lipoperoxidação no fígado 62 . A hiperglicemia estimula a expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS), que é acompanhada pelo aumento da geração de NO. O NO reage com o O2.-, formando o potente oxidante peroxinitrito, aumentando assim a peroxidação dos lipídios, alterando o metabolismo das 28 proteínas, a oxidação das proteínas de baixa densidade (LDL) e afetando as vias de sinalização e transdução celular 64 Em recente trabalho de nosso grupo de pesquisa foi avaliado o potencial antioxidante do extrato aquoso de Agaricus blazei Murril, também conhecido como ‘’cogumelo do sol’’. O estudo avaliou o potencial in vitro do extrato e também a utilização como tratamento em um modelo crônico de DM induzido por estreptozotocina. Este estudo demonstrou que o Agaricus blazei, por possuir um efeito antioxidante, reduz o dano tecidual pulmonar dos ratos diabéticos e melhora os parâmetros metabólicos lipêmicos 65 . Em outro trabalho desenvolvido pelo nosso grupo de pesquisa, avaliamos o estresse oxidativo hepático em um modelo de diabetes experimental crônico induzido por estreptozotocina. Neste estudo, ficou evidenciado um aumento significativo da expressão hepática da subunidade p65 do fator de transcrição nuclear NFƙB e da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) nos animais diabéticos, além do estresse oxidativo no fígado gerado por um período de hiperglicemia crônica 66. iNOS, IL-6 e TNF-α são fortemente estimulados pelo Fator Nuclear B (NF-B) 67 , um fator de transcrição originalmente descoberto em linfócitos B, 68 essencial para diversas sinalizações da resposta inflamatória, função imune, ativação de células endoteliais e controle do crescimento celular . O NF-B é normalmente localizado no citoplasma ligado a uma proteína inibitória da família IB. Uma variedade de estímulos inflamatórios podem utilizar um caminho de sinalização específica, capaz de desligar os IB do fator B, através da fosforilação dos IB por enzimas na família das IB cinases (IKK), induzindo sua degradação. Desta forma, o NF-B é liberado, possibilitando sua translocação ao núcleo e consequente ligação ao DNA, onde é efetivamente responsável pela expressão de genes inflamatórios 69 . Os genes alvo incluem os da ciclo-oxigenase-2 (COX-2), da óxido-nítrico sintase induzível (iNOS), de diversas citocinas inflamatórias e quimiotáticas, receptores de citocinas, moléculas de adesão celular, assim como genes virais 69 . O NF-B é ativado pelo complexo IKK, responsável por fosforilar IBα (inibidor do NF-κB), induzindo sua degradação. IKK e NF-B, estão diretamente envolvidos na inativação do receptor de insulina, sendo a obesidade um fator positivamente correlacionado, onde no fígado de diferentes modelos animais de obesidade 29 tais como HFD, camundongos ob/ob ou ratos fa/fa, a atividade do IKK-β e NFB está aumentada 70. Estes estudos experimentais corroboram a hipótese de que o diabetes possui um efeito lesivo no fígado e a hiperglicemia crônica pode contribuir para a progressão inflamatória da DHGNA em pacientes. 30 1.5 Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) compreende um amplo espectro de lesões hepáticas que vão desde simples esteatose, evoluindo para esteatohepatite (ou esteatohepatite não alcoólica- EHNA), até um quadro de fibrose avançada e cirrose (Figura 4) 71 . Este quadro lembra a injúria hepática induzida pelo álcool, no entanto ocorre em pacientes sem história de abuso desta substância. As implicações clínicas da DHGNA têm repercussão devido a sua prevalência cada vez maior na população geral. A DHGNA deve ser diferenciada de esteatose com ou sem hepatite de causa secundária, uma vez que elas têm patogênese e prognóstico distintos 72 . A prevalência da DHGNA varia de 10 a 51%, dependendo da população estudada e da metodologia utilizada (séries clínicas de imagens, ou autópsia estudos e rastreamento na população geral) com um consenso de 20-30% para os países Ocidentais 74 10, 73 . Estudos que têm contado com alteração nos marcadores séricos da função hepática para determinar a prevalência de NAFLD apresentam números mais baixos do que os estudos mais recentes que utilizaram ultra-som ou ressonância magnética para diagnosticar esteatose hepática 75 . Com base em estimativas, a prevalência de EHNA na população 73 em geral de Países ocidentais é cerca de 2 a 3% . Muito pouca informação está disponível sobre a incidência de DHGNA, no entanto, os resultados de 10 anos de acompanhamento de uma coorte de indivíduos mostraram que 20% deles apresentaram esteatose hepática, correspondendo a uma incidência de 2% ao ano76. 31 Figura 4: Esquema da progressão da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica. Ângulo, 200272. A DHGNA pode compor a síndrome metabólica, juntamente a hipertrigliceridemia, hipertensão arterial, obesidade central, hiperglicemia e diminuição de lipoproteínas de alta densidade 6-8 . Obesidade, diabetes mellitus tipo II (DM II) e dislipidemia são as co-morbidades mais comumente associadas à DHGNA, doença que afeta qualquer faixa etária ou grupo racial. Em pacientes com DHGNA, a prevalência da obesidade relatada em várias séries é de 30 a 100%, DM II de 10-75% e dislipidemia de 20 a 92% 9. Pacientes obesos têm um aumento de 4,6 vezes na prevalência de DHGNA, quando comparados a indivíduos não obesos saudáveis. Pacientes diabéticos tipo II, independentemente do índice de massa corporal (IMC), têm aumento significativo na prevalência e gravidade da DHGNA. Metade dos pacientes dislipidêmicos apresentaram sinais compatíveis com DHGNA em um estudo no qual avaliação por ultrassom abdominal foi utilizada 77. A patogênese da DHGNA é pouco conhecida e a razão pela qual alguns pacientes desenvolvem somente esteatose, enquanto outros evoluem para esteatohepatite, fibrose e posteriormente para cirrose hepática, não está completamente esclarecida. As razões para diferentes desfechos da mesma doença parecem sofrer influência de fatores agravantes, como idade avançada, IMC e presença de DM II, além de diferenças na distribuição de gordura ou nos sistemas oxidativos influenciados pela predisposição genética 78 . O surgimento da DHGNA decorre da retenção de lipídios dentro dos hepatócitos, principalmente na forma de triglicérides. Pacientes com DHGNA apresentam 32 níveis aumentados de ácidos graxos circulantes, este aumento está associado ao aumento dos níveis séricos de glicose e triglicérides 79 . Estes ácidos graxos livres, além de substrato para a síntese de triglicérides pelos hepatócitos são também fonte de energia para outros tecidos, diminuindo, a demanda por energia ao fígado, produzindo um balanço positivo e levando ao acúmulo de triglicérides. Diferentemente do glicogênio, que possui um limite de acúmulo, triglicérides se acumulam em gotas que podem aumentar em tamanho e ocupar grande parte do citoplasma do hepatócito 81, 82 80 . A resistência à insulina leva ao acúmulo de gordura nos hepatócitos em consequencia de lipólise e hiperinsulinemia . Este aumento nos níveis intra-hepáticos de ácidos graxos é fonte de estresse oxidativo e peroxidação lipídica, mediados pelo fator de necrose tumoral α (TNF-α) e endotoxinas. A peroxidação lipídica está associada à ativação das células hepáticas estreladas e à síntese do colágeno tipo I, presente no tecido fibrótico hepático 83, 84 . Figura 5: Fisiopatologia da da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica: Adipócitos podem atuar como sinalizadores imunológicos resultando em um estado de infamação crônica e na 85 progressão da DHGNA com inflamação e fibrose. Adaptado de Grattagliano, 2008 . 33 Nosso grupo de pesquisa já demonstrou as alterações hepáticas em um modelo experimental de DM e o envolvimento de vias de transcrição nuclear redox-dependentes, como o fator de transcrição nuclear NF-κB. A hiperglicemia crônica estabelecida pelo modelo resultou na ativação do NF-κB, aumento da expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e lipoperoxidação no fígado 62. O tecido adiposo parece contribuir para a doença hepática, como depósito de triglicérides e ácidos graxos livres, liberados em resposta à demanda energética. Também age como um órgão regulador do equilíbrio energético e como um órgão endócrino, secretando inúmeras adipocinas biologicamente ativas, como adipsina, adiponectina, leptina, fator inibidor do ativador do plasminogênio 1, resistina e TNF-α. Estas adipocinas estão envolvidas na gênese e evolução da DHGNA, destacando-se a adiponectina e a leptina 86. A maior parte dos pacientes com DHGNA não apresentam sintomas ou sinais clínicos de doença hepática no diagnóstico inicial, porém alguns pacientes podem referir queixas inespecíficas de fadiga, mal-estar e sensação de plenitude ou desconforto no abdômen superior direito. Hepatomegalia é o único sinal ao exame físico em muitos pacientes. A presença de estigmas de doença hepática crônica e diminuição do número de plaquetas sugerem doença avançada com cirrose estabelecida. Uma grande proporção de pacientes com diagnóstico de cirrose criptogênica no passado apresentava vários sinais clínicos e características demográficas, sugerindo DHGNA como provável causa da cirrose 87 . A anormalidade laboratorial mais comumente encontrada na DHGNA é a elevação discreta a moderada de alanina aminotransferase (ALT) e/ou aspartato aminotransferase (AST) sérica, sendo o aumento da ALT até 3 vezes o valor de referência. A relação AST/ALT é geralmente menor que 1, aumentando proporcionalmente com o aumento da fibrose hepática, até a fase de cirrose quando esta relação perde sua eficácia diagnóstica. Fosfatase alcalina e/ou gamaglutamil transpeptidase (GGT) estão acima do limite normal em muitos pacientes, não sendo, porém, tão elevadas quanto na hepatite alcoólica88. 34 A DHGNA é histologicamente indistinguível da doença hepática causada pelo álcool. A biópsia hepática pode mostrar alterações como esteatose, infiltração inflamatória celular mista, balonização de hepatócitos, necrose, núcleo de glicogênio, corpúsculos hialinos de Mallory e fibrose. A esteatose apresenta-se, predominantemente, como gordura macrovesicular e, quando discreta, está tipicamente concentrada na zona acinar três, sendo de distribuição difusa quando moderada ou grave. O infiltrado inflamatório usualmente consiste de neutrófilos e linfócitos, predominando na zona três. A balonização é resultante do acúmulo intracelular de fluidos, levando a edema celular. Corpúsculos hialinos de Mallory são encontrados nos hepatócitos balonizados da zona três, não sendo este achado específico de DHGNA. A presença de fibrose na DHGNA sugere doença mais avançada com dano hepático grave. Uma revisão de vários estudos, compreendendo um total de 673 biópsias hepáticas, mostrou que até 66% dos pacientes no momento do diagnóstico apresentam algum grau de fibrose, sendo esta estádio 3 em 25% e cirrose em 14% 72 . O arranjo da fibrose é uma das características da DHGNA. Certas características, como dano histológico no momento do diagnóstico da DHGNA e sua evolução, têm grande valor no prognóstico desta doença. A análise de diferentes séries envolvendo pacientes que foram submetidos à biópsias de fígado e que foram seguidos num período que variou de 3,5 a 11 anos, mostrou que 28% destes pacientes apresentou progressão da lesão hepática, 59% permaneceu essencialmente igual e 13% mostrou melhora ou resolução da lesão hepática. Casos em que se verificam esteatose pura à biópsia inicial parecem ter o melhor prognóstico dentro do espectro da DHGNA, enquanto esteato-hepatite ou fibrose avançada é associada ao pior prognóstico 89 . A progressão para fibrose hepática observa-se apenas em pacientes com processo de necrose inflamatória à primeira biópsia hepática. Pacientes com esteatohepatite exibiram alto índice de mortalidade relacionada à doença hepática, o que pode ser explicado pelo aumento da prevalência de cirrose entre estes pacientes 7, 90. 35 1.6 Vias de sinalização pró-inflamatórias ativadas na obesidade O tecido adiposo já foi considerado uma massa inerte de energia armazenada com propriedades de isolamento térmico e de apoio mecânico 91 . Recentemente, ele emergiu como um regulador mestre da homeostase energética do corpo92, 93. Em 1990, Hotamisligil e colaboradores evidenciaram que adipócitos podem liberar uma enorme quantidade de TNF-α. Este trabalho resultou em interesse no estudo do potencial inflamatório de tecido adiposo 93 . A partir destes estudos descobriu-se que adipócitos podem liberar uma multiplicidade de adipocitocinas que sinalizam para hepatócitos e células musculares esqueléticas, iniciando a resistência à insulina 94. O tecido adiposo é o principal responsável pela resposta do organismo à insulina. A redução da expressão do transportador de glicose sensível a insulina GLUT4 na superfície dos adipócitos aumenta disponibilidade de glicose para o corpo inteiro e pode gerar resistência insulínica no fígado e músculo esquelético 95. A associação entre obesidade e níveis elevados de TNF-α levou a indentificação do tecido adiposo como maior local de produção desta citocina. Em conjunto com a interleucina-6 e quimiocinas, o TNF-α medeia a infiltração por macrófagos que ocasiona o processo inflamatório do tecido adiposo na obesidade. A ativação do NFΚB é realizada por intermédio do TNF-alfa e pelo estresse oxidativo. O aumento do estresse oxidativo é considerado o principal fator para a progressão da DHGNA de esteatose para esteatohepatite 96 . O estresse do retículo endoplasmático é considerado um fator chave para o desenvolvimento do diabetes e pode contribuir para a progressão da DHGNA. O Retículo Endoplasmático (RE) é uma organela citosólica especializada na regulação do metabolismo de lipídios, da glicose, do colesterol e de proteínas 97 . Células secretoras especializadas como hepatócitos, células β-pancreáticas e adipócitos podem adaptar as funções do 36 RE devido ao aumento da demanda na síntese de proteínas. Em condições de super-nutrição, o adipócito decompõe o seu RE e, após um ponto crítico, começa a fornecer proteínas mal formadas. Para conter este dano, o RE do adipócito gera uma resposta à proteínas mal formadas 97, 98 . Esta resposta resulta na inibição seletiva na síntese de novas proteínas, na transcrição de chaperonas e na ativação do c-Jun N-terminal cinase (JNK). A ativação do JNK conduz a uma variedade de efeitos, tal como a apoptose, inflamação e resistência à insulina 99 . No núcleo, o JNK aumenta a expressão de genes inflamatórios através da ativação do fator de transcrição AP-1 91. Figura 6: Aspectos pró-inflamatórios relacionados com a obesidade e resistência insulínica. Adipócitos apresentam estado de estresse celular nas organelas retículo endoplasmático (RE) e mitocôndria. O adipócito também pode atuar como um sinalizador sistêmico aumentando de 91 inflamação no músculo e fígado. Adaptado de Mittra, 2008 . Obesidade, resistência à insulina e diabetes mellitus tipo 2 (DM II) estão fortemente associados à inflamação crônica caracterizada pela produção anormal de citocinas pelo tecido adiposo. A resposta inflamatória que surge 37 durante o desenvolvimento da obesidade parece depender do “estresse” celular provocado pelo acúmulo de lípides no tecido adiposo, sendo desviada para o fígado e músculo100. Uma numerosa lista de genes sugere a interação entre genes reguladores do metabolismo e o sistema imune: TNFα, leptina, adiponectina, resistina, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, PCR entre outros. Por exemplo, o fator de necrose tumoral  (TNFα) é conhecido por ativar cascatas de transdução de sinais incluindo algumas vias criticamente envolvidas na inibição da ação da insulina, como a ativação de JNKs (c-Jun N-terminal cinase) na inflamação. TNFα também é altamente expresso no tecido adiposo e músculo esquelético de indivíduos obesos, e quando administrado endogenamente induz resistência à insulina 93 101 . A inibição desta citocina em modelo de ratos obesos apresenta um aumento na captação de glicose estimulada por insulina no tecido adiposo . TNFα diminui a sinalização da insulina por induzir a fosforilação do IRS-1 na Ser307 do músculo esquelético, tecido adipose e fígado, e foi demonstrado que, no fígado, esta citocina age de forma dependente de JNK 102 . Além disso, TNFα é um potencializador de diversas citocinas inflamatórias, gerando uma retroalimentação positiva para a inflamação. A gordura corporal é determinante nessa relação, pois o tecido adiposo também libera IL-6, que age sobre o músculo esquelético, interferindo na captação de glicose 91 . Outro fator agravante para tal resposta é o aumento na produção de óxido nítrico (NO) através do aumento da expressão (transcrição) da forma induzível da óxido nítrico sintase (iNOS). Quando em grande quantidade, o NO pode se tornar citotóxico, comprometendo diversas funções celulares incluindo a sensibilidade do receptor de insulina 103. Foi demonstrado que a obesidade “sobrecarrega” a capacidade funcional do retículo endoplasmático (RE) e que este “estresse”, conhecido como estresse do RE, conduz à ativação de vias de sinalização inflamatórias e contribui, assim, para a resistência à insulina 104 . Além disso, o metabolismo da glicose aumentado induz a produção mitocondrial de espécies reativas do oxigênio (ROS). A produção de ROS está bastante elevada na obesidade, o que provoca a ativação aumentada de vias inflamatórias 105. Várias serino/treonino-cinases são ativadas por estímulos inflamatórios ou fatigantes e contribuem para a inibição da sinalização da insulina, o que inclui a ativação de 38 JNK. Novamente, a ativação desta cinase na obesidade evidencia a sobreposição de vias metabólicas e imunes, particularmente IKK e JNK,. Os três membros do grupo de JNK (JNK-1, -2, -3) pertencem à família de proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPK) e regulam múltiplas atividades no desenvolvimento e função das células, em grande parte, através da sua capacidade de controlar a transcrição por fosforilação do fator AP-1 (activator protein-1), incluindo c-Jun e JunB 106 . JNKs surgiram recentemente como reguladoras metabólicas centrais, desempenhando um papel importante no desenvolvimento de resistência à insulina na obesidade107. Em resposta a estímulos, tais como estresse do RE, citocinas, e os ácidos graxos, JNKs são ativadas fosforilando o IRS-1 na Ser307, induzindo prejuízo na ação da insulina 108 . Na obesidade, a atividade de JNK é elevada no fígado, músculo, e tecido adiposo enquanto que, em animais deficientes no gene JNK1 (JNK1-/-), observa-se uma diminuição na concentração de glicose e insulina plasmáticas, bem como da gordura corporal total 108 109 . Curiosamente, a isoforma JNK2 desempenha um papel significativo na aterosclerose, embora aparentemente não no diabetes do tipo 2 . 39 1.7 Ativação da JNK e proteínas de choque térmico Na síndrome metabólica, adipócitos e macrófagos secretam citocinas inflamatórias (como o TNF-α) que ativam a serina-treonina cinase – cjun terminal cinase (JNK) e o inibidor do κB cinase (IKK) nos tecidos sensíveis a ação da insulina (fígado, músculo e gordura). As C-Jun N-terminal cinase(JNK), também denominadas SAPKs, é um dos 3 membros da superfamília de proteínas cinase ativadas por mitógenos (MAPK), que também incluí a cinase reguladora de sinal extracelular (ERKs) e a p38 MAPK 110. JNKs ligam-se e fosforilam c-Jun na serina 63 e 73 com o domínio de transcrição. Estas proteínas são responsivas ao estímulo de estresse, principalmente através de sinalização inflamatória e estão envolvidas na apoptose e diferenciação de células T. As JNKs possuem 10 isoformas expressas por 3 genes: JNK1 (4 isoformas), JNK2 (4 isoformas) e JNK3 (2 isoformas). A JNK1 está envolvida na apoptose, neurodegeneração, e diferenciação de e proliferação através da celular, AP-1. condições inflamatórias produção citocinas Recentemente, a JNK1 foi relacionada com a renovação de proteínas pela fosforilação e ativação da ubiquitinina ligase110. Em modelo experimental de EHNA ficou evidenciado que a JNK1, ao contrário da JNK2, promove o desenvolvimento de esteatohepatite 111 . O JNK e IKK prejudicam a ação do receptor para a insulina, reduzindo a sinalização deste hormônio. Uma consequência do prejuízo da ação da insulina é a deposição lipídica nos hepatócitos e adipócitos, que elevam a produção de metabólitos lipídicos (ceramida e diacilglicerol) 101 . Por sua vez, estes metabólitos lipídicos ativam diretamente o JNK e IKK, ampliando o defeito na sinalização da insulina. O bloqueio desta rota inflamatória em camundongos geneticamente modificados, pela administração de agentes anti-inflamatórios ou pelo exercício protege contra o desenvolvimento da resistência insulínica induzida pela obesidade112. 40 Figura 7: Obesidade e hiperlipidemia aumentam níveis plasmáticos de ácidos graxos livres e ativam JNK nos hepatócitos. JNK1 contribui para resistência insulínica hepática através da fosforilação da serina 307 e estresse mitocondrial. Vias de estresse oxidativo, estresse de retículo endoplasmático no hepatócito também estão ativadas. JNK também ativa células inflamatórias que contribuem para liberação de citocinas inflamatórias. Adaptado de Seki113. Outro fator que está presente no diabetes e contribui para um estado pró-inflamatório é a baixa expressão de proteínas de choque térmico (do inglês: heat schock proteins-HSP)114. Proteínas de choque térmico são chaperonas ativadas em situações de estresse celular que apresentam um papel importante na homeostase. Estas proteínas são formadas por uma sequência genômica altamente conservada entre espécies podendo ser encontrada em seres eucariotos e procariotos. Proteínas de choque térmico (HSPs) são ferramentas eficazes para estender o tempo de vida de invertebrados. Em mutantes C. elegans daf-2, a longevidade resultante da perda da sinalização da insulina e do fator de crescimento relacionado a insulina (IGF) é pelo menos parcialmente dependente da expressão elevada da HSP 115 . A expressão das HSPs é dependente de uma situação de estresse físiológico, químico ou ambiental que induz a ativação do fator de transcrição (fator de choque térmico - do inglês: heat shock factor - HSF) por um processo denominado 41 trimerização. Este processo constitui da conversão da forma monomérica inativa extra-celular do HSF em um heterocomplexo hábil em ligar-se ao DNA com alta afinidade116. A família de HSFs é representada por 4 membros (HSF1, HSF-2, HSF-3 e HSF-4), sendo o HSF-1 o fator presente nos principais tecidos e células de vertebrados. A expressão do HSF-1 é dependente de estímulos estressores e regulada através de feedback negativo pela presença das HSPs117. Diferenças nas expressões de HSPs em diferentes populações e tecidos enfatizam que a capacidade de resposta natural ao estresse pode ser dependente do tipo celular ou do estímulo. As HSPs são classificadas de acordo com o seu peso molecular, sendo que as proteínas que possuem de 66 a 78 KDa (HSP70) estão mais expressas em mamíferos118. A HSP70 pode ser classificada por duas isoformas, a constitutiva (HSP73 ou HSC70) presente nas células em situações basais e a induzida (HSP72) rapidamente em situações de estresse. Esta chaperona molecular reconhece e liga-se a proteínas sintetizadas, dobradas ou localizadas de forma inapropriada, auxiliando na restauração da estrutura e função natural destas, além de fornecer integridade a componentes celulares como membrana plasmática, núcleo e mitocôndria 119. Figura 8: Expressão das proteínas de choque térmico (HSPs). O processo de trimerização constitui da conversão da forma monomérica inativa extra-celular do fator de transcrição das proteínas de choque térmico (HSF-Heat Shock Factor) em um heterocomplexo hábil em ligar120 se ao DNA com alta afinidade e induzir a expressão da HSP70 . 42 A falta de resposta intracelular da HSP72 ao estresse pode ser relacionada aos níveis de resistência à insulina em células do músculo esquelético 121 . Esta baixa resposta ao estresse em células de pacientes diabéticos parece estar relacionada com a ativação de proteínas envolvidas na resposta inflamatória (e sensíveis a alterações no estado redox), tais como a JNK. O DM II está associado a uma redução a uma baixa expressão do fator de transcrição de proteínas de choque térmico (do inglês: Heat shock factor-1 HSF-1), das HSPs. A ativação do HSF-1 e a subsequente expressão das HSPs pode produzir uma estado anti-inflamatório geral 122. Em particular, a HSP70 pode bloquear a ativação do JNK e IKK e fatores de transcrição como o NFκB123. Melhoras na sensibilidade à insulina foram observadas com a indução da expressão de HSP70 em pessoas diabéticas. Em situações de desafio, como exercício físico, ou após tratamento com choque térmico (forte indutores desta proteína), há um bloqueio da ativação de mediadores da resposta inflamatória, como JNK e IKK no músculo esquelético 123 . De fato, camundongos submetidos a uma dieta hiperlipídica (HFD) apresentam um aumento na taxa de fosforilação do IKK/ (Ser180/181), o que é completamente revertido em camundongos 107 transgênicos para HSP70 (HSP72+/+) mesmo se submetidos a HFD . Além disso, HSP72 também tem um papel importante na diminuição da atividade do NF-B, não somente por atuar sobre o complexo IKK, mas também por ativar IKKβ em tecidos como o músculo esquelético124. Outro mecanismo sugerido seria através de uma possível inibição competitiva sobre o HSF-1, fator de transcrição da HSP70, que quando ativado, diminui a capacidade de ligação do NF-B ao DNA 125 . Essa regulação pode limitar a atividade de intermediários de cascatas inflamatórias, como a da iNOS que, em células transfectadas com HSP70, apresenta a expressão de seu gene diminuída em resposta ao estresse, restringindo a alta produção e liberação de NO por estas células 125 . 126 A atividade do NF-B também é dependente de outros indutores inflamatórios, como p38MAPK, mesmo na ausência de ativação das IKK .A indução de HSP72 pode comprometer a atividade da p38 em diferentes situações, como em coração isolado estimulado com hormônios da tireoide, 43 onde a taxa de fosforilação da p 38MAPK cai pela metade em resposta a isquemia enquanto que em cultura de células, sua atividade é fortemente diminuída após tratamento com diferentes estimuladores da expressão de HSP72120. A expressão desta proteína também está ligada à diminuição da atividade de JNK . Efeitos provocados pelo aumento na taxa de fosforilação de JNK no gastrocnêmio de animais HFD, como intolerância à glicose e resistência à insulina, são atenuados ou completamente revertidos após tratamento com choque térmico, o que também é observado em camundongos transgênicos HSP72+/+ 107 . Esse mecanismo de inibição das JNK ocorre rapidamente e de forma dose-dependente em linhagens de células NIH 3T3 de fibroblastos previamente chocados. Porém, essa regulação não sofre interferência das vias de estimulação de JNK, tais como MAPKs como Erk e p38, mas sim através de uma interação direta entre JNK1 em um domínio específico da HSP72 122 . Além disso, alguns estudos têm demonstrado a 127, 128 capacidade da HSP70 em ligar-se diretamente ao receptor de insulina que, apresenta uma alta taxa de recuperação após choque térmico As JNK induzem hiperfosforilação do HSF-1, . (e, inativando-o consequentemente, bloqueando uma possível resposta de resolução de inflamação)122. Na verdade, estudos sugerem que a ativação do HSF-1 seja regulada por JNK2, e não por JNK1 129, 130 , um clássico indutor de HSP70 via HSF-1. Assim, a ativação exacerbada da sinalização pró-inflamatória pode induzir falhas no funcionamento de mecanismos celulares de sinalização da insulina, além de contribuírem para a diminuição na capacidade de expressar HSP70, que é anti-inflamatória e capaz de reverter completamente os bloqueios da sinalização de insulina provocados por respostas inflamatórias crônicas (mesmo que de baixo nível). Uma vez que a Esteatohepatite Não Alcóolica é uma condição patológica e metabólica associada ao estado inflamatório do tecido adiposo a avaliação de marcadores de estresse oxidativo e das proteínas de choque térmico é muito importante para melhor compreender o processo de progressão da doença. Portanto, o presente estudo objetiva através de pesquisa translacional identificar vias pró-inflamatórias hepáticas presentes no modelo de diabetes experimental e em pacientes com Doença Hepática Gordurosa não Alcóolica. 44 2. OBJETIVOS DO ESTUDO 2.1 Objetivo geral Este trabalho tem por objetivo geral avaliar marcadores pró-inflamatórios em um modelo de diabetes experimental e em pacientes obesos com Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica. 2.2 Objetivos específicos 2.2.1 Artigo 1: 1. Determinar o peso corporal e a glicose sanguínea dos animais pertencentes aos diferentes grupos estudados, no momento da indução do DM e no dia do sacrifício. 2. Avaliar a lipoperoxidação mediante a determinação das substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) no fígado. 3. Determinar a expressão da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) hepática nos diferentes grupos estudados. 4. Determinar a expressão da nitrotirosina hepática nos diferentes grupos estudados. 5. Determinar a expressão nuclear da p65 no fígado dos diferentes grupos estudados. 2.2.2 Artigo 2: 1. Analisar parâmetros clínicos de altura, peso, índice de massa corpórea (IMC), idade e bioimpedância para determinação do percentual de gordura corporal em pacientes com doença hepática gordurosa não alcoólica submetidos à cirurgia da obesidade. 2. Avaliar nos pacientes as enzimas aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), gama glutamil transpeptidase (GGT) e 45 fosfatase alcalina (FA), assim como a dosagem das bilirrubinas totais e frações. 3. Avaliar a dosagem sérica do colesterol total, HDL, LDL, triglicérides, glicemia, hemoglobina glicada (HbA1) e insulina sérica. 4. Avaliar a resistência à insulina dos pacientes através do índice HOMA (homeostatic model assessment). 5. Avaliar a lipoperoxidação no plasma através da técnica de determinação das substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). 6. Avaliar a atividade da enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD) plasmática. 7. Classificar a doença hepática gordurosa não alcóolica segundo a progressão e estadiamento através das alterações histológicas apresentadas pelo tecido hepático biopsiado no trans-operatório. 8. Avaliar através do método Western Blot a ativação da serina-treonina cinase – cjun terminal cinase (JNK) através da expressão das proteínas JNK1, JNK2, p-JNK1, p-JNK2 no tecido adiposo biopsiado no transoperatório. 9. Avaliar através do método Western Blot a expressão das proteínas de choque térmico (HSPs) HSP70 e do fator de transcrição heat shock factor 1 (HSF-1) no tecido adiposo biopsiado no trans-operatório. 10. Avaliar através do método Western Blot a ativação da serina-treonina cinase – cjun terminal cinase (JNK) através da expressão das proteínas JNK1 e p-JNK1 no tecido hepático biopsiado no trans-operatório. 11. Avaliar através do método Western Blot a expressão das proteínas de choque térmico (HSPs) HSP70 no tecido hepático biopsiado no transoperatório. 12. Avaliar através da imunofluerescência a expressão e a distribuição tecidual da HSP70 e do HSF-1 no tecido hepático. 46 3- MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Artigo 1 3.1.1 Delineamento do estudo: Estudo de caráter experimental, quantitativo, aplicando modelo de indução experimental de diabetes através da utilização da estreptozotocina. Conforme apresentado no artigo: Hepatic Nitrosative Stress in Experimental Diabetes. Journal of Diabetes and Its Complications 26 (2012) 378–381. 3.1.2 Animais e protocolo experimental O protocolo experimental utilizado estava de acordo com as normas estabelecidas pela Comissão de Pesquisa e Ética em Saúde do Grupo de Pesquisa e Pós-Graduação do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, bem como o preconizado no Principles for Research Involving Animals. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto Alegre sob o número 08-543. Foram utilizados ratos machos, da linhagem Wistar, provenientes do biotério do Instituto de Ciências Básicas da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). O peso médio dos animais no início do estudo foi de 200 a 300 g. Os animais foram mantidos em ambiente com temperatura controlada de 22+4 °C em ciclo de 12 horas claro/escuro (luz das 7 às 19 horas). O experimento foi realizado na Unidade de Experimentação Animal do Centro de Pesquisas do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. O DM foi induzido por única injeção 131 intraperitoneal (i.p.) de estreptozotocina - STZ (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, EUA) na dose de 70 mg/Kg de peso corporal . A STZ foi dissolvida em tampão citrato de sódio (0,1 M, pH 4,5) e ácido cítrico (0,1 M, pH 4,5) e administrada na região abdominal esquerda do animal cerca de 10 minutos após a diluição em solução tampão. Os animais do grupo controle receberam somente NaCl 0,9% i.p. no mesmo volume do tampão utilizado para dissolver a STZ. 47 Para determinação da glicemia foi utilizado o teste enzimático colorimétrico (Kit ENZI-COLOR, Bio Diagnóstica), no qual um reagente foi misturado a 20 L de amostra do plasma e lido em espectofotômetro (CARY 3E – UV- Visible Spectrophotometer Varian) com comprimento de onda de 500 nm. Foram considerados diabéticos aqueles animais que apresentaram a concentração de glicose sangüínea acima de 250 mg/dL. Foram utilizados 21 ratos machos Wistar, divididos em três grupos com 7 animais cada: controles (CO), diabéticos (DM) e diabéticos tratados com aminoguanidina (DM+AG). A Aminoguanidina (aminoguanidine hemisulfate salt, Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA) foi utilizada na dose de 50 mg/kg (i.p.) durante os últimos 30 dias de experimento 132. Após o período de 60 dias de DM os animais foram mortos por exsanguinação após anestesia profunda. O sangue foi retirado do seio retroorbital foi centrifugado durante 15 minutos, para dosagem da glicemia sangüínea e o fígado foi retirado, pesado, colocado em porções e congelado a -80°C para posteriores dosagens. 3.1.3 Preparo dos homogeneizados de fígado Colocou-se 9 mL de tampão fosfato (KCL 140 mM, fosfato 20 mM pH 7,4) por grama de tecido. Foi utilizado o PMSF, um inibidor de proteases, para que não haja degradação das enzimas posteriormente medidas. O órgão foi homogeneizado em Ultra-Turrax (IKA-WERK) durante 40 segundos, à temperatura de 0 a 2° C. Esse homogeneizado foi centrifugado refrigeradamente (SORVALL RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge) por 10 min a 3000 rpm (1.110 x g). O precipitado foi desprezado e o sobrenadante retirado, congelado em freezer em temperatura de -80° C para ser usado para as dosagens. Foi homogeneizado um grama de fígado em 4 mL de tampão fosfato sódico (0,2 M, pH 6,5) e centrifugado a 100.000 x g durante 60 minutos a 4°C. A fração total coletada para a realização dos experimentos posteriores foi o sobrenadante. 48 3.1.4 Dosagem de proteínas A concentração de proteínas foi determinada utilizando o método Bradford. O método de Bradford depende da união quantitativa de um corante, o Coomassie Brilliant Blue, a uma proteína desconhecida e a comparar esta união a diferentes quantidades de uma proteína padrão. Como padrão utilizouse uma solução de albumina bovina 1 mg/mL (nos volumes de 50, 100 e 150 L). Foi adicionado 40 μL do reativo BioRad Protein Assay e lido em absorbância de 595nm 133. 3.1.5 Medida das Substâncias que Reagem ao Acido Tiobarbitúrico A técnica de Medida das Substâncias que Reagem ao Acido Tiobarbitúrico (TBARS) consiste no aquecimento do homogeneizado com o ácido tiobarbitúrico e na conseqüente formação de um produto corado, medido em espectrofotômetro a 535 nm. O aparecimento de coloração ocorre devido à presença do malondealdeído e outras substâncias provenientes da peroxidação lipídica no material biológico. As amostras de tecido foram colocadas em tubo de ensaio, nesta ordem de adição, 0,75 mL de ácido tricloroacético (TCA) 10%, 0,25 mL do homogeneizado, 0,5 mL de ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,67% e 25 mL de água destilada. O TBA reage com produtos da lipoperoxidação formando uma base de Schiff, e o TCA tem a função de desnaturar as proteínas presentes, além de acidificar o meio da reação. Posteriormente, agitou-se cada tubo e fez-se a incubação em 100 ° C por 15 minutos. Após, os tubos foram resfriados e acrescentado 1,5 mL de álcool n-butílico para extrair o pigmento formado. Eles então foram colocados em agitador (Biomatic) por 45 segundos e centrifugados por 10 minutos a 3000 rpm (1110 x g). Por último o produto corado foi retirado e lido em espectrofotômetro (CARY 3E - UV - Visible Spectrophotometer Varian) com um comprimento de onda de 535 nm. A concentração de TBARS obtida foi expressa em nmol por mg de proteína 134 . 49 3.1.6 Western blot Para determinação da expressão das proteínas nitrotirosina, iNOS e p65 por Western Blot os fragmentos de tecido hepático foram extraídos inteiros e coletados em tubo de ensaio tipo falcon contendo SDS 0,1% (5mL/g de tecido) e inibidores de protease (Fluoreto de Fenilmetilsulfonila (PMSF) 100μM, N-tosilL-lisina clorometil-cetona (TLCK) 20μM, Aprotinina 2μg/mL e Leupeptina 2μg/mL), para serem homogeneizados em homogeneizador de facas Ultra 80. Em seguida, o conteúdo foi centrifugado a 16.000g por 1 minuto a temperatura ambiente e o sobrenadante coletado. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford (Bradford 1976), sendo as amostras diluídas em tampão para eletroforese (50 mM Tris pH 6,8, SDS 10% (w/v), glicerol 10% (v/v), 2-mercaptoetanol 10% (v/v) e 2 mg/mL azul de bromofenol) e fervidas por 5 minutos para desnaturação completa das proteínas. Quantidades iguais de proteína (~40µg por poço) foram aplicadas em gel de poliacrilamida a 10%, para separação durante 4 horas utilizando corrente elétrica constante a 15 mA por gel. Foi utilizado o sistema vertical Slab Gel BIO-RAD Mini-Protean TetraCell (BIO-RAD Laboratories, Richmond, CA, USA) preenchido com tampão de corrida contendo Tris a 25 mM e SDS a 1% (m/v), pH 8,3. Foi usado como marcador de peso molecular 5 µL de mistura de proteínas recombinantes pré-coloridas (RPN800E, GE Health Care) por gel. Para a realização do procedimento de eletrotransferência, onde ocorre a transferência das proteínas para uma membrana de nitrocelulose (GE Health Care-Amersham), foi utilizado o sistema refrigerado BIO-RAD Blot Cell a 100V constantes por 90 minutos. A confirmação do sucesso dos procedimentos descritos acima foi confirmada pela coloração da membrana de nitrocelulose com Vermelho Ponceau S (Red Ponceau S, sal de sódio 0,3%, Sigma, em solução de ácido tricloroacético a 3%) e em seguida descoradas com solução TEN (Tris-EDTA-NaCl a respectivamente 50, 5 e 150 mM)-Tween 0,1% (v/v). O procedimento de imunoblotting foi realizado em aparelho específico com uso de sistema de vácuo (SNAP i.d., MilliPore), otimizando o tempo de reação dos anticorpos sendo 1) incubação instantânea a vácuo com 15 mL de 50 tampão de bloqueio (leite em pó desnatado a 0,5% em TEN-Tween 0,1%); 2) incubação por 10 minutos com anticorpo especifico anti-nitrotyrosine, anti-iNOS polyclonal antibody, specific p65 antibody (Cell Signalling Technology); 3) Três lavagens instantâneas a vácuo com 15 incubação 135 mL TEN-Tween 0,1% após cada . A imunodetecção foi realizada por quimiluminescência com uso de Luminol, ácido p-coumárico e H2O2, sendo a quimiluminescência fotodocumentada (60 fotos, 1foto/10seg) e as imagens quantificadas com auxilio do sistema automático ImageQuant 350 (GE Health Care). 3.1.7 Análise Estatística Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP) e analisados com o programa Statistical Package for Social Sciences versão 15.0 (SPSS-15.0). As variáveis foram testadas para normalidade pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Uma análise de variância (ANOVA) para as diferenças entre grupos. O pós-teste de Student-Newman-Keuls foi utilizado para variáveis paramétricas. O nível de significância foi de 5% (p <0,05). O tamanho da amostra foi calculado por meio de um estudo piloto, que determinou que a utilização de sete ratos proporcionaria significância estatística para a análise de lipoperoxidação hepática. 51 3.2 Artigo 2 3.2.1 Delineamento do estudo: Estudo transversal analítico. Foram avaliados pacientes obesos classe III e IV submetidos à cirurgia bariátrica com biópsia hepática comprobatória de Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica. Segundo apresentação no artigo: Obesity depresses the anti-inflammatory HSP70 pathway contributing to the progression of NAFLD in obese patients, submetido à Clinical Science, ISSN:0009-9287. 3.2.2 Pacientes Pacientes adultos com diagnóstico de obesidade grave, que foram submetidos ao tratamento cirúrgico da obesidade no Centro de Obesidade e Síndrome Metabólica do Hospital São Lucas (COM - PUC / RS) foram incluídos no estudo. O Comitê de ética do Hospital São Lucas aprovou o estudo (CEP 11/05544- ANEXO I). Todos os participantes incluídos no estudo assinaram o termo de consentimento informado (ANEXO II). Os pacientes com evidência de uso excessivo de álcool (≥ 10 g / dia), as outras causas de doenças do fígado (por exemplo, hepatite B, hepatite C, doença hepática auto-imune), e aqueles que receberam tratamento com agonistas de PPAR-γ (do inglês: Peroxissome proliferator-activated receptor γ) foram excluídos. No pré-operatório foram coletados dados demográficos, exame físico (peso, altura e impedância bioelétrica para determinar a porcentagem de gordura corporal) e testes laboratoriais de função hepática, incluindo aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT). Colesterol total, HDL, LDL glicose, triglicérides, insulina e sorologia para hepatite B e C também foram avaliados. Os níveis de glucose foram medidos pela glicose oxidase kits com base em (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), de acordo com o protocolo 52 do fabricante. Os níveis de insulina no soro foram quantificados por ELISA em sanduíche (LINCO Research, St. Charles, MO, EUA). Para o diagnóstico de resistência à insulina é usada HOMA (modelo de avaliação hemostático) calculada pela fórmula [insulina em jejum (μIU / mL) x glucose plasmática em jejum (mg / dl) / 22.5], utilizando o ponto de corte igual ou superior a 3,0 136 . As amostras de sangue foram coletadas através de punção de veia da fossa antecubital no período pré-operatório. Todas as amostras de sangue, após centrifugação para obtenção de soro foram separadas em alíquotas, armazenadas em freezer a – 80°C para as posteriores dosagens. Todos os pacientes incluídos neste estudo foram submetidos à cirurgia de gastroplastia redutora com derivação intestinal em “Y de Roux”. Neste procedimento, um reservatório gástrico de 20-40ml foi criado após o grampeamento do estômago proximal. O estômago distal foi conectado a alça de jejuno distal anastomosada ao reservatório gástrico formando um “Y”. Durante o procedimento cirúrgico, aproximadamente 15mg de tecido hepático da borda do lobo esquerdo foi biopsiado e armazenado a – 80 °C para as posteriores dosagens. O tecido adiposo visceral (100 mg) foi biopsiado e armazenado congelado a -80 °C para posterior análise. Durante o procedimento cirúrgico, cerca de 15 mg de tecido de tecido hepático também foi biopsiado e armazenado em paraformaldeído. 3.2.3 Estudo histológico As biópsias de fígado foram fixadas em formol, processadas rotineiramente para histologia, seccionadas e coradas com hematoxilina-eosina e picrossirius. Todas as lâminas foram avaliadas por um patologista cegado. O grau de esteatose e inflamação portal, inflamação lobular, infiltrado de polimorfonucleares, hipertrofia das células de Kupffer, corpos apoptóticos, necrose focal de parênquima, núcleos de glicogênio, vacuolização hepatocelular, e os corpúsculos de Mallory tiveram suas características histológicas avaliadas em cortes corados com hematoxilina-eosina. A fibrose foi avaliada através da técnica de coloração de picrossirius. A DHGNA foi classificada segundo Matteoni e colaboradores, considerando-se esteatohepatite os casos que apresentavam algum grau de balonização 53 hepatocelular. Casos que apresentem esteatose hepatocelular e algum grau de fibrose perissinusoidal também foram considerados como esteatohepatite. A esteatose macrovacuolar será classificada de acordo com o percentual de hepatócitos acometidos como ausente (menos de 5%), grau 1 (5 a 25%), grau 2 (>25% a 50%), grau 3 (>50 a 75%), grau 4 (> 75%). A fibrose será classificada como grau I (fibrose perivenular e/ou perisinusoidal limitada à zona 3), grau II (fibrose perivenular e/ou perisinusoidal em zona 3 com fibrose portal e/ou formação de septos fibrosos finos), grau III (presença de septos fibrosos ligando veias centrais entre si e/ou veias centrais à área portal, com poucos nódulos parenquimatosos observados) e grau IV (cirrose). Cada biópsia hepática foi atribuída a uma das três categorias de diagnóstico: esteatose, esteatohepatite não alcoólica (EHNA) e fibrose perissinusoidal 7. 3.2.4 Detecção das HSPs através da imunofluorescência As reações de imunofluorescência foram realizadas nos cortes de tecido hepático pela técnica de complexo estreptavidinabiotina-peroxidase (StreptABC, DAKO). As lâminas foram previamente revestidas por solução de silano (APTS – Sigma A3648) diluído a 4% em acetona. Os cortes obtidos foram de 3μm de espessura após microtomia mecânica. Os cortes foram desparafinizados e preparados por passagens sucessivas por xilol e etanol e submetidos à recuperação antigênica pelo calor com irradiação por panela de pressão (Eterna, Nigro) utilizando-se tampão citrato 10mM pH 6.0 por 15 minutos. O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com solução de peróxido de hidrogênio a 3%, seguida da incubação com o anticorpo primário HSP70 (Sigma H5147, produzido em camundongos, anti-HSP70) que reconhece tanto a indutível 72-kDa, tal como a forma constitutiva de 73-kDa. Para determinar a expressão de HSF-1 foi utilizado anti-HSF-1 (Sigma SAB4501448-100ug, produzidos em coelhos). Para a marcação das células de Kupffer foi utilizado o anticorpo anti-CD14 produzido em coelhos As reações foram reveladas com solução de diaminobenzidina (DAB, Sigma) a 60mg%. 54 3.2.5 Análises bioquímicas de estresse oxidativo Amostras de sangue foram coletadas com heparina e centrifugadas a 1613xg rpm por 5 minutos a 4ºC. O plasma foi armazenado e os eritrócitos foram lavados 3 vezes com o mesmo volume de solução salina (NaCl 0,9%), sendo o sobrenadante discartado a cada lavagem e os eritrócitos separados. Dez µL de eritrócitos foram pipetados para a medida da concentração de hemoglobina de acordo com o método de Drabkin. Outros 100 µL de plasma foram pipetados para determinar os produtos gerados pela lipoperoxidação através do método thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) e a medida foi realizada espectrofotometricament a 535nm 137. 3.2.6 Atividade da Superóxido Dismutase (SOD) A determinação da SOD nos eritrócitos foi realizada segundo MIRSA e FRIDOVICH (1972). O método está baseado na inibição por superóxido dismutase da formação de adrenocromo na autoxidação da epinefrina. SOD 2 O 2- + 2H+ ------------ H2 O2 + O2 Considerando que a epinefrina permanece estável em soluções ácidas e espontaneamente se oxida em soluções básicas, favorecendo a formação de adrenocromo, a SOD pôde ser medida espectrofotometricamente seguindo a troca de absorbância de epinefrina a 480nm onde apresenta um pico de absorbância. Para a reação ocorrer foi preparada uma mistura com volume final de 1 mL com: tampão bicarbonato (0,05 M; pH 10,2), fração citosólica e epinefrina (4 mM). A absorbância utilizada foi de 480 nm, a 30°C. A reta padrão foi elaborada com concentrações crescentes de SOD (20 a 100 nM) para determinar a que concentração da mesma se produz a inibição da autoxidação da epinefrina em 50% e os resultados foram expressos em 55 U/mg de hemoglobina. Uma atividade enzimática se define como a quantidade de enzima que é capaz de inibir 50% da autoxidação da epinefrina 138. 3.2.7 Western blot Para determinação da expressão das proteínas HSP70, HSF-1, JNK1, pJNK1, JNK2 e pJNK2 por Western Blot os fragmentos de tecido hepático e adiposo foram extraídos inteiros e coletados em tubo de ensaio tipo falcon contendo SDS 0,1% (5mL/g de tecido) e inibidores de protease (Fluoreto de Fenilmetilsulfonila (PMSF) 100μM, N-tosil-L-lisina clorometil-cetona (TLCK) 20μM, Aprotinina 2μg/mL e Leupeptina 2μg/mL), para serem homogeneizados em homogeneizador de facas Ultra 80. Em seguida, o conteúdo foi centrifugado a 16.000g por 1 minuto a temperatura ambiente e o sobrenadante coletado. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford (Bradford 1976), sendo as amostras diluídas em tampão para eletroforese (50 mM Tris pH 6,8, SDS 10% (w/v), glicerol 10% (v/v), 2-mercaptoetanol 10% (v/v) e 2 mg/mL azul de bromofenol) e fervidas por 5 minutos para desnaturação completa das proteínas. Quantidades iguais de proteína (~40µg por poço) foram aplicadas em gel de poliacrilamida a 10%, para separação durante 4 horas utilizando corrente elétrica constante a 15 mA por gel. Foi utilizado o sistema vertical Slab Gel BIO-RAD Mini-Protean TetraCell (BIO-RAD Laboratories, Richmond, CA, USA) preenchido com tampão de corrida contendo Tris a 25 mM e SDS a 1% (m/v), pH 8,3. Foi usado como marcador de peso molecular 5 µL de mistura de proteínas recombinantes pré-coloridas (RPN800E, GE Health Care) por gel. Para a realização do procedimento de eletrotransferência, onde ocorre a transferência das proteínas para uma membrana de nitrocelulose (GE Health Care-Amersham), foi utilizado o sistema refrigerado BIO-RAD Blot Cell a 100V constantes por 1:30 horas. A confirmação do sucesso dos procedimentos descritos acima foi confirmada pela coloração da membrana de nitrocelulose com Vermelho Ponceau S (Red Ponceau S, sal de sódio 0,3%, Sigma, em solução de ácido tricloroacético a 3%) e em seguida descoradas com solução TEN (Tris-EDTA-NaCl a respectivamente 50, 5 e 150 mM)-Tween 0,1% (v/v). 56 O procedimento de imunoblotting foi realizado em aparelho específico com uso de sistema de vácuo (SNAP i.d., MilliPore), otimizando o tempo de reação dos anticorpos sendo 1) incubação instantânea a vácuo com 15 mL de tampão de bloqueio (leite em pó desnatado a 0,5% em TEN-Tween 0,1%); 2) incubação por 10 minutos com anticorpo especifico mouse anti-human HSP70 monoclonal antibody (Sigma H5147) que reconhece ambas 73-kDa constitutive HSC70 (HSPA8 gene) e 72-kDa inducible HSP70 (HSPA1A gene). HSF-1 rabbit polyclonal anti-human HSF-1 (Sigma SAB4501448). JNK1 e JNK2 foram reveladas com mouse anti-human JNK monoclonal antibody (Sigma SAB4200176, clone 1C2). Activated phospho-JNK1 e phospho-JNK2 foram detectadas com mouse anti-human monoclonal antibody (Sigma J4750, clone JNK-PT48) ; 3) Três lavagens instantâneas a vácuo com 15 mL TEN-Tween 0,1% após cada incubação 135. A imunodetecção foi realizada por quimiluminescência com uso de Luminol, ácido p-coumárico e H2O2, sendo a quimiluminescência fotodocumentada (60 fotos, 1foto/10seg) e as imagens quantificadas com auxilio do sistema automático ImageQuant 350 (GE Health Care). 3.2.8 Análise Estatística Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (SD) e foram analisados por meio de software estatístico SPSS 15.0. As variáveis foram testadas para normalidade pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Uma análise de variância (ANOVA) foi utilizada para as diferenças intergrupais. O teste post hoc de Bonferroni foi utilizado para variáveis paramétricas e KruskalWallis para não-paramétricos. O nível de significância adotado foi de P <0,05. 57 4. RESULTADOS 4.1 Artigo 1 HEPATIC NITROSATIVE STRESS IN EXPERIMENTAL DIABETES (Publicado em Journal of Diabetes and its Complications- 26 (2012) 378–381) 58 59 60 61 62 4.2 Artigo 2 Obesity depresses the anti-inflammatory HSP70 pathway contributing to the progression of NAFLD in obese patients Submetido à Clinical Science sob o número CS 2013/0390. 63 Obesity depresses the anti-inflammatory HSP70 pathway contributing to the progression of NAFLD in obese patients Authors: Fábio Cangeri Di Naso1, Henrique Sarubbi Fillmann1,2, Lucas Maggioni2, Alexandre Vontobel Padoin2, Rafael Jacques Ramos2, Claudio Corá Mottin2, Rossana Rosa Porto3, Aline Bittencourt3, Paulo Ivo Homem de Bittencourt Jr. 3, Norma Possa Marroni 1,4*. Affiliations: 1 Laboratory of Physiology and Experimental Hepatology, Porto Alegre Clinics Hospital, Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS). 2 Center of Obesity and Metabolic Surgery, São Lucas Hospital, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul (PUCRS). 3 Laboratory of Cellular Physiology, Institute of Basic Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS and National Institute of Hormones and Women’s Health, Brazil. 4 Lutheran University of Brazil, Canoas, RS (ULBRA) Running title: Obesity depresses HSP70 in NAFLD * Correspondence: Prof. Norma Possa Marroni, 1Laboratory of Physiology and Experimental Hepatology, Experimental Research Center, Porto Alegre Clinics Hospital, Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS), Rua Ramiro Barcelos 2350, 90035-903 Porto Alegre, RS, Brazil. Telephone: +55 (51) 33598937; Fax: +55 (51) 33084555; E-mail: nmarroni@terra.com.br 64 ABSTRACT Objective: To evaluate whether reduced activity of the anti-inflammatory 70kDa heat shock protein (HSP70) pathway correlates with the progression of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) and markers of oxidative stress. Design and Subjects: Adult patients (95) diagnosed with severe obesity who underwent surgical treatment of obesity were divided into steatosis (ST), steatohepatitis (SH) and fibrosis (SH+F) groups. The expression of heat shock protein (HSP70), its major transcription factor heat shock factor-1 (HSF-1) and c-jun amino-terminal kinases (JNK1 and JNK2) were assessed by immunoblotting from hepatic and visceral adipose tissue. Results were confirmed by immunohistochemistry (IHC). Metabolic parameters (lipids, HbA 1c and HOMA), hepatic enzymes and redox markers (thiobarbituric acid reactive substances and total superoxide dismutase) were evaluated in the plasma. Results: In both liver and adipose tissue, decreased HSP70 expression, paralleled by similar reduction in HSF-1 expression and reduced plasma antioxidant enzyme activities, were observed that are associated with insulin resistance and the degree of NAFLD progression (expressions were: ST>SH>SH+F). IHC studies suggested Kupffer cells were the major site of HSP70 inhibition. Conversely, JNK1 expression and phosphorylation was increased at the same pace in adipose tissue while only JNK1 enhancements were observed in the liver. Conclusion: Obesity-elicited decrease in HSF-1 expression in Kupffer cells impairs HSP70-dependent anti-inflammation with consequent increase in oxidative stress and insulin resistance in advanced stages of NAFLD. The possible causal effect of fat cell senescence to these processes is discussed. Keywords: Obesity, non-alcoholic fatty liver disease, heat shock proteins, oxidative stress, cellular senescence. 65 INTRODUCTION The increasing worldwide prevalence of obesity and high fasting glucose, which are interdependent risk factors for nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), have become a major healthcare problem 1 . In turn, NAFLD encompasses a broad spectrum of successive and progressive pathological conditions that circumscribe hepatic steatosis, its inflammatory variant, nonalcoholic steatohepatitis (NASH), progressive fibrosis and cirrhosis 2. Since obesity is accompanied by an inflammatory status in metabolic tissues 3 and adipose tissue-derived hormones influence hepatic function, including in NAFLD 4, the cross-talk between fat and liver has been subject of attention 5, 6 . Visceral adipose tissue is inherently pro-inflammatory, although inflammation has also been observed in stressed subcutaneous adipose tissue in obesity 7 . Important consequences include the release of macrophage cytokines, notably macrophage chemotactic protein 1 (MCP-1) and tumor necrosis factor-α (TNFα) 8. Moreover, although the complete sequence of events linking obesity to inflammation and insulin resistance has not been fully settled, the mechanism by which excess lipids/fuels trigger low-grade inflammation in both adipocyte and liver contributing to impaired insulin responsiveness involves the activation of c-Jun NH2-terminal kinases (JNKs), endoplasmic reticulum (ER) stress, unfolded protein response (UPR), ceramide, and low grade of inflammatory response 9, 10 . In fact, impaired response to stress (e.g. high blood glucose and fatty acid levels) in the cells from diabetic patients is connected with the activation JNK cascades 11 , whereas TNFα- elicited activation of JNK is a major constituent of free fatty acid-induced insulin resistance 12. 66 If, on the one hand, obesity operates in the sense of activation of JNKs, which feeds forwardly systemic inflammation, on the other, stress (inflammation)-induced expression of the 70-kDa family of heat shock proteins (HSP70) works in opposite direction. Besides the now classical molecular chaperone action, the most remarkable intracellular effect of HSP70 is its antiinflammatory action under stressful situations. Accordingly, HSP70 blocks nuclear factor B (NF-B) activation at different levels, e.g. by impeding the phosphorylation of inhibitor of B (IBs) 13 , by directly binding to IB kinase gamma (IKK)14, thus inhibiting downstream inflammatory signals, which is corroborated by the finding that HSP70 assembles with liver NF-B/IB complex in the cytosol thus hindering further transcription of NF-B-depending TNF and NOS-2 genes that worsen severe inflammation in rats 14 . Also, stress-induced HSP70 inhibits JNK-dependent signal transduction that leads to programmed cell death 15 . The remarkable anti-inflammatory action of HSP70 when intracellularly located also explains why cyclopentenone prostaglandins (cp-PGs), which are physiological inducers of HSP70 expression, are powerful anti-inflammatory autacoids 16-18 . Nonetheless, one of the most striking observations during the installation of obesity states is the decreased expression of HSP70 in both skeletal muscle 19 and adipose tissue of obese patients 20, this being consistently associated with insulin resistance. This is why enhanced HSP70 expression has been convincingly demonstrated to protect against obesity-induced insulin resistance in both humans and animal models of obesity 21 while pharmacological (e.g. the hydroxylamine derivative BGP-15, now under clinical trial) as well as physiological (hyperthermic, hot tube) 67 treatments have started to be cogitated as promising therapeutic approaches in type 2 diabetes 22. The interconnection between obesity, inflammation and HSP70 pathways encompasses a much more complex network operating at gene regulatory level. The promoter region of TNF gene contains an HSF-1 (heat shock transcription factor-1) binding site that represses TNF transcription, and thus loss of this repressor results in sustained expression of TNF 23, which explains why HSF-1 knockout is associated with a chronic increase in TNF levels and increased susceptibility to endotoxin challenge 24 . Regulation of this network in the opposite directions has also been reported: TNF may transiently repress HSF-1 activation 25 . Furthermore, JNK1 was convincingly demonstrated to phosphorylate HSF-1 in its regulatory domain causing suppression of HSF-1 transcribing activity 26 while HSP70 prevents Bax activation both by inhibiting the JNK/Bim pathway and by interacting with Bax in UV-induced apoptosis 27. Taken together, the above observations led us to investigate whether HSP70 pathways could be impaired in the liver and adipose tissue of NAFLD patients thus allowing for JNK-triggered inflammatory signals to reach metabolic tissues. Moreover, systemic oxidative stress markers were analyzed in order to assess the relationship between HSP70-elicited anti-inflammation and the progression of NAFLD. 68 MATERIALS, SUBJECTS AND METHODS Subjects and procedures This study was approved by the institutional review boards (Federal University of Rio Grande do Sul and Hospital São Lucas). Ninety-five adult patients (75 women/20 men) with a diagnosis of severe obesity, who were submitted to surgical treatment of obesity at the Center for Obesity and Metabolic Syndrome of Hospital São Lucas (COM – PUC/RS) were included in the study. The Hospital São Lucas local ethics committee approved the study (CEP 11/05544). All participants provided their written informed consent. Patients with intraoperative liver biopsy confirming the diagnosis of NAFLD (please, see below) were included in the study and then divided into the following groups: steatosis (ST), steatohepatitis (SH) and steatohepatitis with fibrosis (SH+F). Patients with evidence of excessive alcohol use (≥10 g/day), other causes of liver disease (e.g., hepatitis B, hepatitis C, autoimmune liver disease), and those receiving treatment with PPAR-γ agonists were excluded. All the patients included in this study underwent surgery with Roux-en-Ygastric bypass, which involves anastomosing the proximal gastric pouch to a segment of the proximal jejunum bypassing most of the stomach and entire duodenum. During the surgical procedure, approximately 15 mg of liver tissue from the edge of the left lobe was biopsied and stored in p-formaldehyde for histology. Visceral adipose tissue (100 mg) and liver (15 mg) were also biopsied and stored frozen at -80 °C for subsequent analysis. Preoperatively, it were collected demographic data, physical examination (height, weight and bioelectrical impedance to determine body fat percentage) and laboratory liver function tests including aspartate aminotransferase (AST), 69 alanine aminotransferase (ALT). Serum total cholesterol, HDL, LDL, triglycerides, glucose and insulin, and serology for hepatitis B and C also were evaluated. Glucose levels were measured by glucose oxidase-based kits (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) according to the manufacturer’s protocol. Insulin levels in serum samples were quantified by sandwich ELISA (LINCO Research, St Charles, MO, USA). For diagnosis of insulin resistance, homeostasis model assessment (HOMA-IR) was applied as follows: fasting insulin (μIU/mL) x fasting plasma glucose (mg/dL)/22.5. In terms of patient peripheral insulin resistance, HOMA-IR values were equal of or higher than 3.0, consistent with previously observed 28 . Blood samples were collected by puncturing the vein of the antecubital fossa at the initial preoperative period. All blood samples were centrifuged, separated into working aliquots and frozen at -86 °C for subsequent analysis. Histopathology Each liver biopsy specimen was fixed in buffered p-formaldehyde, routinely processed for histology, sectioned, and stained with hematoxylin– eosin (HE) or picro-sirius (PS) red techniques. All biopsies were evaluated by a blinded hepatopathologist. The degree of steatosis and portal inflammation, lymphoplasmacytic lobular inflammation, polymorphonuclear lobular inflammation, Kupffer cell hypertrophy, apoptotic bodies, focal parenchymal necrosis, glycogen nuclei, hepatocellular ballooning, and Mallory bodies were assessed in HE stained slices (Supplementary Fig. 1A-C). Fibrosis was assessed via PS red staining analysis (Supplementary Fig. 1D-F). Portal fibrosis and interlobular pericellular fibrosis were graded as follows: 0 = none, 70 1 = mild, 2 = moderate, and 3 = marked. When present, bridging fibrosis was noted as few or many bridges, and cirrhosis was identified by parenchymal nodules surrounded by fibrous tissue. Each liver biopsy was assigned to one of three diagnostic categories: steatosis with nonspecific inflammation (ST, Supplementary Fig. 1A and D), nonalcoholic steatohepatitis (SH, Supplementary Fig. 1B and E) and perisinusoidal fibrosis (F, Supplementary Fig. 1C and F) 29. Protein Separation and Detection. In order to examine protein expression, biopsies of liver (15 mg) and adipose tissue (100 mg) were prepared as described above and processed for sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblot analyses as adapted from elsewhere 20 . Briefly, tissues were homogenized (still frozen) in 0.1% (w/v) SDS buffer containing protease and phosphatase inhibitor cocktail (Sigma) consisting of Leupeptin (4,2 M), Aprotinin (0,31 M), TLCK (N-Tosyl-L-Lysine Chloromethyl Ketone, hydrochloride; 20 M), PMSF (Phenyl-Methyl-Sulfonyl Fluoride, 100 M), Sodium Orthovanadate (Na3VO4; 1 mM), Sodium Molybdate (Na2MoO4; 1 mM), -Glycerophosphate (1 mM). Afterwards, homogenates were centrifuged at 16000 x g for 1 min at room temperature and supernatant fractions were saved for protein determination 30 by using bovine serum albumin (BSA, Sigma) as standard. Then, equivalent amounts of protein from each sample (~ 40 g) were mixed with Laemmli’s gel loading buffer [50 mM Tris, 10% (w/v) SDS, 10% (v/v) glycerol, 10% (v/v) 2-mercaptoethanol and 2 mg/ml bromphenol blue] in a ratio of 1:1, boiled for 5 min and electrophoresed in a 10% polyacrylamide minigel for 4 h 15 mA/gel. Proteins were transferred onto nitrocellulose membranes (GE 71 HealthCare) according to the electrotransfer (Bio-Rad) manufacturer’s instructions (2 h, 100 V) and transferred bands were visualized with 0.3% (w/v) Red Ponceau S (Sigma) in 3% (w/v) trichloroacetic acid solution to be photodocumented (ImageQuant 350, GE HealthCare). For immunoblotting procedures, SNAP i.d. (Merck Millipore) quick immunoblot vacuum system was used and membranes were washed with water and then blocked in 0.5% (w/v) non-fat dry milk (Nestlé) in wash buffer [TEN-Tween 20 solution (0.1% w/v)]. Membranes were washed three times with wash buffer and incubated for 10 min with mouse anti-human HSP70 monoclonal antibody (Sigma H5147) which recognizes both the 73-kDa constitutive HSC70 (HSPA8 gene) and the 72-kDa inducible HSP70 (HSPA1A gene) forms, at 1:1000 dilution. HSF-1 was detected in adipose tissue samples with rabbit polyclonal anti-human HSF-1 (Sigma SAB4501448), which recognizes both phosphorylated and unphosphorylated isoforms of HSF-1. In liver biopsies, HSF-1 expression was not tested due to tissue size constraints. Total (quiescent unphosphorylated plus activated diphosphorylated) JNK1 and JNK2 were revealed with mouse anti-human JNK monoclonal antibody (Sigma SAB4200176, clone 1C2), which specifically discriminates between 43-kDa JNK1 and 55-kDa JNK2 isoforms. Activated phospho-JNK1 and phospho-JNK2 were detected with mouse anti-human monoclonal antibody (Sigma J4750, clone JNK-PT48), which specifically recognizes both the 46-kDa p-JNK1 and 54-kDa p-JNK2 isoforms diphosphorylated at their regulatory sites Thr183 and Tyr185. After three washings with wash buffer, peroxidase-labeled rabbit anti-mouse IgG (Sigma A9044) or peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG (Sigma A0545) were utilized as secondary antibodies, at 1:10,000 dilution. As a gel loading control, 72 peroxidase-labeled mouse anti-human -actin monoclonal antibody (Sigma A3854) was used at 1:25,000 dilution). Data are given as the mean  S.D. of expressions normalized in terms of -actin. Immunofluorescence Detection Immunostaining reactions were performed in 3-m p-formaldehyde-fixed deparaffinized/re-hydrated permeabilized sections of hepatic tissue mounted onto (3-aminopropyl)-triethoxysilane/acetone treated slides after antigen retrieve (15 min at 100 °C in 10 mM citrate buffer pH 6.0). Then, tissue slices were incubated for 1 h at room temperature with a mix of mouse anti-human HSP70 (1:400) and rabbit anti-human HSF-1 (1:50) in a 1% (w/v) BSA solution in PBS (blocking buffer). Antibodies were the same described for western blotting procedures (above). For HSP70/Kupffer cell co-localization, a mix of mouse anti-human HSP70 (Sigma, H5147) and rabbit anti-human CD14 (Sigma, HPA001887, 1:500 dilution) antibodies in BSA/PBS solution was applied onto the slices. Afterwards, slices were washed three times in blocking buffer (5 min each) and then incubated at room temperature for 1 h with secondary fluorescent antibodies [FITC-labeled rabbit anti mouse IgG (Sigma, F9137, 1:500) and Cy3-labeled sheep anti-rabbit (Sigma, C2306, 1:200)] in blocking buffer. Fluorescence stabilization and counterstaining were performed by using Fluorshield with DAPI (Sigma, F6057). Negative controls with either no primary or secondary antibodies were processed in parallel to confirm the results. Images were acquired in a motorized (DIC) semi-confocal phaseOlympus model IX81 contrast/differential interference contrast fluorescence microscope equipped with a xenon lamp (X-cite EXFO-Lumen 73 Dynamics) and ColorView III Peltier-cooled CCD 5-Mpixel (Soft Imaging) camera. Data were analyzed via Olympus Cell F software. Biochemical Analyses of Oxidative Stress Blood was collected with heparin and centrifuged at 1613xg rpm for 5 min at 4ºC. The plasma was discarded and the erythrocytes were rinsed 3 times with the same volume of saline solution (NaCl 0.9%), the supernatant being discarded at each rinsing and the red cells reserved. Ten µL of rinsed red cells was pipetted for hemoglobin measurement according to the Drabkin technique. Another 100 mL of rinsed red cells were pipetted to determine the products generated by lipid peroxidation through the method of thiobarbituric acid reactive substances TBARS technique and was spectrophotometrically measured at 535 nm 31. Superoxide dismutase (SOD) activity in erythrocytes was determined using a technique based on the inhibition of adrenochrome formation in epinephrine auto-oxidation 32. Statistical Analysis The data are presented as mean ± standard deviation (SD) and were analyzed through statistical software SPSS 15.0. The variables were tested for normality through the Kolmogorov-Smirnov test. One-way analysis of variance (ANOVA) was used for intergroup differences. Bonferroni post hoc test was used for parametric variables and Kruskal-Wallis for the nonparametric ones. The level of significance used was P<0.05. 74 RESULTS General Anthropometric data from enrolled patients are depicted in Table 1 (Please, see also Supplementary Table 1 in the online version of this manuscript). From an overall 95 type III obese patients (BMI > 45 kg.m-2), 75 (79%) were women whereas 20 (21%) were men. According to histological characterization, patients were classified as presenting steatosis (ST, 28.4%), steatohepatitis (SH, 40%) or steatohepatitis accompanied by fibrosis (SH+F, 31.6%). Despite marked differences in NAFLD presented by them, there was no observable difference in BMI, waist circumference, percentage of body fat or obesity degree (Supplementary Table 1). The same in relation to plasma lipids (Table 1). Such similarities, however, were not circumscribed to the data related to glycemic control, as SH and SH+F patient groups showed increased insulin resistance (HOMA-IR), glycated hemoglobin, and fasting glycemia and insulinemia as compared to ST group (Table 1). It is noticeable that HOMA-IR values in SH and SH+F patients were within the double of that found in ST obese individuals (P<0.004). Plasma liver enzymes were also higher in SH+F and SH patients with NAFLD in comparison with ST group, as expected, denoting a higher degree of hepatic damage and accompanying systemic oxidative stress, as evaluated by TBARS, which allows the assessment of the degree of lipoperoxidation. This was confirmed by a slight but significant decrease in the activity of the antioxidant enzyme superoxide dismutase (SOD), particularly in SH group, as compared to ST patients (Table 1). 75 The incremental inflammatory disease (from ST to SH and SH+F) is clearly denoted by a characteristic leukocyte infiltration within the hepatic tissue of such patients (as typified in Supplementary Fig. 1 A to C). HSP70 vs JNK Status in Adipose Tissue of NAFLD Patients Consistent with the proposal that a progressively higher degree of liver inflammation among NAFLD patients could be related to a parallel rise in inflammatory status in adipose tissue due to a loss of function of HSP70 antiinflammatory and cytoprotective activity, we investigated HSP70 expression in biopsies of visceral adipose tissue from such patients. Noteworthily, total HSP70 (HSP72+HSP73) protein expression in adipose tissue of NAFLD patients was found to be markedly decreased in SH (by 50.4%) and SH+F (by 60.6%) as compared to ST groups (p<0.05), which was perfectly correlated with a conspicuous suppression of HSF-1 expression in the tissues of the same patients, as depicted in Fig. 1: SH (by 48.2%) and SH+F (by 75.8%) as compared to ST group HSF-1 expression (p<0.05). Paralleling these observations, JNK1 and JNK2 (both total and diphosphorylated/activated forms) were found to be remarkably enhanced in the adipose tissue of the same patients (p<0.05). As shown in Fig. 1, total JNK1 expression rose by 92.4% in SH patients and by 122.7% in SH+F individuals as compared to ST volunteers, which was paralleled by an increase by 52.8% (SH) and 56.3% (SH+F) in Thr183/Tyr185-diphosphorylated activated JNK1 (p-JNK1). The same concerning JNK2 expressions: SH patients exhibited an 85.1% rise in total JNK2 while SH+F individuals showed an 85.3%-increase, as compared to SF volunteers. Again, these rises were followed by similar augmentations in 76 p-(Thr183/Tyr185)-JNK2 expression in adipose tissue: by 57.8% in SH and 58.9% in SH+F as compared to ST group. HSP70 vs JNK Status in Hepatic Tissue of NAFLD Patients Liver biopsies from the NAFLD patients were also analyzed for HSP70 (HSP72 and HSP73 forms) and JNKs (JNK1 and JNK2, both total and diphosphorylated activated forms). Similarly to that observed in adipose tissue from the same patients, total HSP70 (HSP72+HSP73) expressions were found to be slightly but significantly decreased as NAFLD prospers (Fig. 2): by 54.2% in SH and by 37.2% in SH+F groups as compared to ST group, this being mainly due to a remarkable reduction in the expression of the inducible form HSP72 (by 89.4% in SH and 87.2% in SH+F groups in relation to ST one) while the cognate HSP70 form (HSP73) showed just a modest fade. Once again, as observed in adipose tissue, liver JNK1 and p-JNK1 expressions were found to be enhanced reciprocally in relation to HSP70 expressions: in relation to ST group, total JNK1 was elevated by 41.7% in SH and by 69.5% in SH+F groups (Fig. 2), whereas Thr183/Tyr185-diphosphorylated activated JNK1 was found to be enhanced by 23.2% in SH and by 41.9% in SH+F groups, thus suggesting that both JNK1 expression and activation were augmented during the course of the inflammatory disease of the liver. It is also of note that SH+F groups showed increased expressions of JNK1 (by 19.6%) and p-JNK1 (by 15.1%) when the comparison is against SH group as well. JNK2 was not detected in the livers of such patients at all. In order to get further insight into the origin of such diverting results, we analyzed NAFLD liver biopsies for HSP70 and HSF-1 expressions by IHC. As 77 shown in Fig. 3, there is a progressive disappearance of HSP70 immunoreactivity in the hepatic tissues of patients as NAFLD proceeds from ST to SH and SH+F (Fig. 3 A to C), this being of the same magnitude of the pace of the reduction in HSF-1 expression (Fig. 3 D to F). Immunofluorescence analysis also showed co-localization of HSP70 and HSF-1 in the slices (Fig. 3 J to L), thus suggesting a causal effect of decreased HSF-1 expression over HSP72 (the inducible form of HSP70) immunodetection, since HSP73 expression is well known not to be influenced by HSF-1 activation/expression 33. This observation reinforces immunoblot analyses performed with the same samples in which HSP72 was the HSP70 form by far most affected by the progression of NAFLD (Fig. 2). Immunofluorescence analyses of hepatic tissues from NAFLD patients (Fig. 3) also revealed an inconsistency between the cellular nature of HSP70/HSF-1 expressions and hepatocytes (expected to respond to NAFLD by changing HSP70 expression), since it was clear in all the slices so far examined that co-localization of HSP70 and HSF-1 expressions (Fig. 3 J to L) was not onto the same cellular structures as were hepatocytes that were clearly located in another histological plane. Because of the shape of the structures (small cells) co-localizing HSP70 and HSF-1 expressions, we conjectured that the cells affected by the progressively decreasing effect of NAFLD over HSP70/HSF-1 expressions could be Kupffer cells. In fact, as shown in Fig. 4, NAFLD-degree-dependent decreased expression of HSP70 in liver slices (Fig. 4 A to C) colocalized with CD14+ Kupffer cells (Fig. 4 D to F and Fig. 4 M to O). 78 DISCUSSION Although body fat percentage and plasma lipids may have a central role in the pathogenesis of NAFLD 28, 34 , the present results showed that these factors did not furnish a reliable marker for the following of the progression of NAFLD from ST to fibrosis. Accordingly, we firstly showed that NFLD may be described as a systemic pathological condition largely related to the state of cellular stress and inflammation in adipose tissue and liver that can be traced in the plasma as alterations in lipoperoxidation. In fact, TBARS measurements which are a straightforward estimate of lipoperoxidation/malondialdehyde produced throughout the body (systemic oxidative stress) were found to be elevated in SH and SH+F groups as compared to ST plasma samples, this being correlated with the degree of insulin resistance as assessed by HOMA-IR (Table 1). On the other hand, plasma levels of SOD, an important antioxidant produced in response to oxidatively stressful situations which is positively correlated with the degree of severity of oxidative stress in metabolic syndrome 35 being frankly augmented in the liver of NAFLD patients 36 , were found not to be correlated with the progression of the disease from its simple ST form towards the more inflammatory SH+F one. The most striking observation from the present study, however, was the demonstration, for the first time, that HSF-1-HSP70 axis is progressively suppressed in adipose tissue and liver of obese patients as NAFLD evolves from SF towards SH+F. Moreover, such a suppression was found to be perfectly correlated with the degree of enhancement of total JNK1 and JNK2 expressions in adipose tissue, which is followed by similar rises in the amounts of Thr183/Tyr185-diphosphorylated activated p-JNK1 and p-JNK2 in the same 79 tissue (Fig. 1). Approximately the same pattern of HSP70 decrease paralleled by a proportionate JNK1 activation was observed in the liver of NAFLD patients. Differently from adipose tissue, however, restraint of the expression of the inducible form of HSP70 (HSP72) was much more evident in the liver while JNK2 expression was not verified in the liver at all (cf. Fig. 1 and Fig. 2), consistently with the notion that JNK1 but not JNK2 promotes the development and aggravation of NAFLD 37. Taken together, the above propositions suggest a causal effect of decreased HSF-1 expression over HSP72 for the progression of NAFLD, since HSP72 expression is entirely dependent upon the induction via HSF-1 pathway (differently from that observed for the constitutive HSP73 form whose expression is HSF-1-independent 33 . As a consequence, JNK-based pro- inflammatory pathways may be derepressed thus allowing for an even enhanced oxidative stress and worsening of the disease inasmuch as HSF-1 may suppress TNF expression activation 25 23 whereas TNF may repress HSF-1 , so that any factor that breaks the poise and transcribing activity 26 of HSF-1 biochemical pathways, easily triggers a vicious cycle of inflammation, oxidative stress, tissue damage and so on. Oxidative stress associated with mitochondrial dysfunction and ER stress are, in turn, triggering factors for the increased expression and activation of JNK and NF-κB and development of a more pro-inflammatory state 6, 12, 38 . In this regard, we have recently shown, in rodent model of diabetes, that increased oxidative and nitrosative stress and reduced antioxidant enzyme activity are the leading cause of redox imbalance-elicited activation of NF-B and tissue damage in the liver of the animals 39-41 that perpetuates inflammation thus 80 avoiding its resolution. In fact, it has recently shown that selective (tissuespecific transgenesis) inactivation of both JNK1 and JNK2 in adipose tissue of mice protects the animals against diet-induced increased adiposity and improves insulin sensitivity in both liver and skeletal muscle 42 . In mammalian tissues, HSP70 are expressed both constitutively (HSP73 or HSC70) and in a stress-inducible way (HSP72). While both HSP70 forms work as molecular chaperones having anti-inflammatory properties, stressful situations that displace cells from the homeostasis (e.g. heat shock, heavy metals, inflammatory signals) quickly trigger HSF-1-dependent transcription of massive amounts of HSP72 to counteract such cellular insults. Therefore, reduced capacity for stress-induced HSP72 expression is at the center of inflammation and insulin resistance in both skeletal muscle tissue of obese patients 20 19 and adipose . In fact, it has irrefutably been demonstrated that HSP72 expression is capital in blocking inflammation and preventing insulin resistance in the context of genetic obesity or high-fat feeding 21. The above considerations, however, raise a capital question as to what is the mechanism underlying a decreased HSF-1-mediated HSP70 expression in adipose tissue and liver? In turn, this points at two corollary and alternate questions: a) is obesity-induced production of systemic low-grade inflammation responsible for the hepatic inflammatory response in such a way that hepatic capacity for counteracting inflammation through the production of antiinflammatory HSP70 response is overridden? or b) does the establishment of obesity somehow induce a failure of correct and orchestrated HSP70 response leading to an inflammatory milieu that is spread out towards whole body (including adipose tissue and liver)? 81 Obesity-induced cellular senescence of adipocytes may be part of the answer to solve these questions. In fact, as pointed out by Tchkonia and coworkers, a senescent-like state can evolve in fat cells from obese individuals (even young ones) that is an adaption to fat cell overutilization which resembles cellular aging 43 . In the same line of evidence is the fact that high fat diet- induced obesity leads to vascular senescence in a process that involves longterm activation of Akt1 and mTOR 44 . On the other hand, fibroblasts from adult segmental progerioid Werner syndrome, which undergo premature senescence, present a strong positive feedback system in which p38-NF-B pathway overactivation leads to a senescence-associated secretion phenotype (SASP) that blocks the expression of the RNA-binding factor HuR, a potentiating factor for the sirtuin SIRT1 which enhances HSF-1 expression 45 . Hence, cellular senescence occludes HSF-1 expression and, consequently, represses a protective anti-inflammatory heat shock response. Because of this, we advocate that the metabolic overburden of fat cells is responsible for cellular senescence that triggers the observed decrease in heat shock response, not only in adipose tissue, but also in the liver and other metabolic tissues (e.g. skeletal muscle, pancreatic islets). A generalized state of systemic inflammation which feeds forward a vicious cycle of inflammation impeding its physiological resolution is just a fatidic consequence. Corroborating the above propositions is the recent finding that hepatocyte senescence predicts NAFLD progression in humans 46 and the fact 47 that hepatocyte senescence is a general marker of human liver cirrhosis which is the next step of NAFLD progression. , 82 Even though one cannot discard the possibility that reduced heat shock response in hepatocytes may account for the aggravation of NAFLD, our results showed that the main target of decreased HSP70 expression in the liver appears to be Kupffer cells (Fig. 4), which renders hepatic tissue much more inflammatory. In fact, we showed that HSP70 expression was significantly and progressively diminished in Kupffer cells of NAFLD patients form ST towards SH+F. Although not completely understood, hepatic free radical generation may exacerbate inflammation through Kupffer cell activation. Moreover, it has been recently shown that amplified pro-inflammatory response of M1 Kupffer cells may account for the severity of NAFLD and its progression to NASH, fibrosis, cirrhosis and, eventually, hepatocellular carcinoma 48 . Also, a growing body of evidence suggests that Kupffer cells critically contribute to progression of NAFLD, in particular because abundant or abnormal lipids may confound recognition of fatty hepatocytes as dangerous and promote adverse interactions with these hepatic macrophages 49 . Still in support to the senescence hypothesis is the observation that experimental Kupffer cell ablation produces a scenario that resembles in much senescence, with reduction of hepatic anti-inflammatory response and predisposition to steatosis and insulin resistance hypothesis is summarized in Fig. 5. To the limit of our knowledge, this is the first study to show a clearly negative and causal correlation between the progression of NAFLD to fibrosis and the expression/activation of HSF-1/HSP72 biochemical pathway in both liver and adipose tissue of the patients. These alterations were found to be associated with reduced antioxidant enzyme activities and enhanced JNK1 and 50 . A tentative picture of such a 83 JNK2 in the adipose tissue and JNK1 in the liver. Suppression of HSP70 expression was also found to be positively correlated with poor maintenance of glucose homeostasis (Table 1) which is of note, since weight gain and baseline HOMA are independent predictors for the development of NAFLD 51 . Finally, these observations may have important diagnostic value for NAFLD patients, because “HSP70 status” may be assessed from circulating blood mononuclear cells in relation to the plasma (for review, please, see ref. 52) helping to predict fat cell senescence and the progression of the disease through minimally invasive procedures52. CONFLICTS OF INTEREST STATEMENT The authors declare no conflict of interest and no competing financial interests in relation to the work described. ACKNOWLEDGEMENTS FCN, RRP and AB completed all the experiments described in this manuscript. HSF, CCM, AVP and RJR. performed the surgeries. All authors were involved in analyzing the results. FCN, PIHBJ and NPM co-wrote the paper. FCN, PIHBJ and NPM designed the study. PIHBJ and NPM provided experimental advice, helped with manuscript revision and were responsible for grant support with respect to Brazilian National Council for Scientific and Technological Development (CNPq, grant ‘Heat Shock Protein Metabolism in Diabetes’ #563870/2010-9, 402626/2012-5 and 402364/2012-0, to PIHBJ) and HCPA FIPE #08-534 which funded the present work. All authors had final approval of the submitted and published versions. 84 SUPLLEMENTARY MATERIAL Supplementary information is available at International Journal of Obesity website. REFERENCES 1. Pi-Sunyer FX. The obesity epidemic: pathophysiology and consequences of obesity. Obesity research 2002; 10 Suppl 2: 97S-104S. Bedogni G, Miglioli L, Masutti F, Tiribelli C, Marchesini G, Bellentani S. Prevalence of and risk factors for nonalcoholic fatty liver disease: the Dionysos nutrition and liver study. Hepatology 2005; 42(1): 44-52. Gregor MF, Hotamisligil GS. Inflammatory mechanisms in obesity. 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Plasmatic parameters of fasting Non Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) obese patients. Groups Variables N (%) AST (U/L) ALT (U/L) Cholesterol (mM) HDL-c (mM) LDL-c (mM) TAG (mM) Glycemia (mM) Insulinemia (pM) HbA1c (%) HOMA-IR TBARS (M) SOD (U/mg protein) ST 27(28.4%) 23.37±10.29 24.55±10.13 5.04 ± 0.79 1.25 ± 0.25 3.05 ± 0.82 1.76 ± 1.38 5.18 ± 1.03 152.6 ±85.4 5.85±.78 4.69 ± 2.64 1.06 ± 0.09 81.92 ± 39.98 SH 38(40%) 27.92±10.12 38.89±18.41 5.19 ± 1.01 1.25 ± 0.28 3.17 ± 0.87 1.99 ± 1.23 6.69 ± 2.80 224.7 ± 115.9 6.63±1.70 9.5 ± 7.85 1.69 ± 0.83 50.87 ± 23.08 SH+F 30(31.6%) 35.10±19.36 51.40±46.55 4.93 ± 1.17 1.28 ± 0.28 2.85 ± 0.87 1.85 ± 0.77 5.97 ± 1.26 229.4 ± 87.1 6.24±.76 8.49 ± 4.05 1.53 ± 0.20 72.26 ± 32.71 .007 .003* .575 .865 .395 .732 .019* .012 .049 .004* .01 * .02* ns .005 ns ns ns ns .015 .03 .03 .005 .01 .05 .005 .01 ns ns ns ns .04 .023 .03 .003 .001 ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns Anova ANOVA P values ST X SH ST X SH+ F SH X SH+F Data are the mean ± S.D. (and percentage of total enrolled patients). *Differences between groups were assessed by ANOVA and Kruskal-Wallis post hoc test. ST, Steatosis; SH, Steatohepatitis; SH+F, Steatohepatitis plus Fibrosis; AST, aspartate aminotransferase; ALT, alanine aminotransferase; HDL-c, high-density lipoprotein cholesterol fraction; LDL-c, low-density lipoprotein cholesterol fraction; TAG, triacylglycerols (in terms of triolein equivalents); HbA1c, glycated hemoglobin; HOMA-IR, homeostatic model assessment; TBARS, thiobarbituric acid reactive substances; SOD, superoxide dismutase activity. Supplementary Table 1. Anthropometric features of Non Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) obese patients. Variables N (% of patients studied) Age (years) Sex (female/male) BMI (kg/m ) Waist circumference (m) Body Fat (%) Obesity degree (%) 2 Steatosis 27(28.4%) 33.78 ± 7.99 26/1 44.56 ± 7.83 1.252 ± 0.193 51.66 ± 2.16 196.87 ± 20.13 Steatohepatitis 38(40%) 38.71 ± 10.02 29/9 46.71 ± 8.38 1.329 ± 0.167 49.03 ± 6.43 199.92 ± 22.51 Fibrosis 30(31.6%) 39.00 ± 9.97 20/10 47.54 ± 6.75 1.329 ± 0.149 48.39 ± 11.23 205.27 ± 27.02 P values 0.081 0.331 0.149 0.647 0.796 Data are the mean ± S.D. (and percentage of total enrolled patients). Differences between groups were assessed by ANOVA and Bonferroni post hoc test. ST, Steatosis; SH, Steatohepatitis; SH+F, Steatohepatitis plus Fibrosis. 90 91 Figure 1. Visceral adipose tissue expression of total HSP70, HSF-1, and JNK1/2. For the immunoblot analysis of protein expressions, tissue biopsy was performed in samples from 22 out of 95 enrolled patients. Six of such patients had Steatosis (ST), ten Steatohepatitis (SH) and six Steatohepatitis+Fibrosis (SH+F). Antibodies to HSP70 detect both the constitutive cognate HSP73 (HSC70) and the inducible HSP72 (HSP70) forms. Antibodies to HSF-1 recognize total (phosphorylated and unphosphorylated) HSF-1 forms, whereas anti-JNK antibodies were specific for either JNK (1 and 2) or diphosphorylated activated JNKs (p-JNK1 and p-JNK2). *P<0.05 for the comparison between ST and SH groups; * *P<0.05 for the comparison between ST and SH+F groups by ANOVA. 92 Figure 2. Hepatic tissue expression of HSP72/HSP73, HSF-1, and JNK1/2. For the immunoblot analysis of protein expressions, tissue biopsy was performed in samples from 22 out of 95 enrolled patients. Samples were as described in the legend of Fig. 2. Antibodies to HSP70 detect both the constitutive cognate HSP73 (HSC70) and the inducible HSP72 (HSP70) forms. Antibodies to HSF-1 recognize total (phosphorylated and unphosphorylated) HSF-1 forms, whereas anti-JNK antibodies were specific for either JNK (1 and 2) or diphosphorylated activated JNKs (p-JNK1 and p-JNK2). *P<0.05 for the comparison between ST and SH groups; * P<0.05 for the comparison between ST and SH+F groups; #P<0.05 for the comparison between ST and SH+F groups by ANOVA. 93 Figure 3. Immunofluorescence analysis of HSP70 and HSF-1 expression in the liver from NAFLD patients. Liver biopsies were collected and fixed as described in the Methods section and then probed with anti-HSP70 (FITC, green; both cognate HSP73 and inducible HSP72 forms) and anti-HSF-1 (red) antibodies. Nuclei were evinced with DAPI counterstaining. Groups are as follows. Steatosis (ST): A, D, G, J (merged); Steatohepatitis (SH): B, E, H, K (merged); Steatohepatitis plus Fibrosis (SH+F): C, F, I, L (merged). Representative immunohistochemistry sections from 22 patients are shown. Samples were as described in the legend of Fig. 2. Original magnification: 40X. 94 Figure 4. Co-localization of HSP70 and CD14 positive cells in the liver from NAFLD patients. Liver biopsies were collected and fixed as described in the Methods section and then probed with anti-HSP70 (FITC, green; both cognate HSP73 and inducible HSP72 isoforms) and anti-CD14 (red) antibodies. Nuclei were evinced with DAPI counterstaining. Phase contrast images from the same sections are also shown. Groups are as follows. Steatosis (ST): A, D, G, J, M (merged); Steatohepatitis (SH): B, E, H, K, N (merged); Steatohepatitis plus Fibrosis (SH+F): C, F, I, L, O (merged). Representative immunohistochemistry sections from 22 patients are shown. Samples were as described in the legend of Fig. 2. Original magnification: 60X. 95 Figure 5. The fat cell senescence hypothesis for the progression of NAFLD. A tentative hypothesis of fat cell senescence as a triggering factor for the development of NAFLD is shown. (A) Under normal nutrient supply (i.e. equivalent to energy expenditure, physical activity), glucose and fatty acids are utilized in adipose tissue upon physiological amounts of insulin. Any excess of demand is counteracted by enhanced heat shock (HS) response in order supply the correct furnishing of chaperones thus avoiding endoplasmic reticulum (ER) 96 stress and the resulting unfolded protein response (UPR). (B) When circulating glucose and fatty acids (especially saturated) overcome energy expenditure and high amounts of surplus energetic metabolites should be stored in adipose tissue under a higher insulin command, ER stress develops. Should energy expenditure be still and chronically lower than energy intake, ER stress is followed by the UPR, a cellular strategy evolved in order to evaluate the capacity of the cell to arrange a physiological HS response (which forwards cells to protein/metabolite homeostasis). In the case of irremediable HS response, cells may undergo apoptosis and irreversible cell death. On the other hand, if proteostasis is not attained but cells still have conditions to avoid apoptosis, an alternative metabolic pathway may be taken in which cells do not dye but activate senescence, assuming a senescence-associated secretion phenotype (SASP), which maintains senescence by increased production of SASP cytokines that chronically depress the expression of the RNA-binding factor HuR. However, HuR acts by binding to SIRT1 mRNA increasing its stability and translation, thus allowing the transcription of HSF-1, a capital transcription factor responsible for the correct HSP72 synthesis, HS response, and blockage of inflammatory cytokine production (e.g. TNF, IL1) and pathways (e.g. JNK, NF-B). Therefore, fat cell senescence produces a systemic inflammatory response that spreads out towards all the tissues, including the liver, in which adipose tissue-derived SASP triggers a similar process of hepatocyte/Kupffer cell senescence which promotes loss-of-function phenotype that culminates in steatosis rapidly shifting to steatohepatitis, fibrosis, cirrhosis and, eventually, hepatocellular carcinoma. These suppositions may importantly impact NAFLD patient follow-up, because “HSP70 status” can be assessed from circulating blood mononuclear cells in relation to the plasma, helping to predict fat cell senescence and the progression of the disease through minimally invasive procedures. 97 5. DISCUSSÃO Pesquisas translacionais são inicialmente estabelecidas através do uso de modelos animais para posterior aplicação dos resultados desses estudos básicos na prática clínica. Existem diversos modelos experimentais de indução de doenças metabólicas e inflamatórias que possibilitam o conhecimento de mecanismos responsáveis pela progressão das doenças. Esta relação entre a pesquisa experimental e a pesquisa clínica é fundamental para que descobertas recentes já se tornem procedimentos aplicados, reduzindo o tempo destinado para que os primeiros benefícios sejam estabelecidos. A Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica é considerada atualmente a doença hepática mais prevalente no mundo ocidental e está relacionada principalmente com a obesidade. A DHGNA abrange a esteatose hepática, a esteatohepatite e formas mais graves da doença hepática como cirrose e carcinoma hepatocelular. A doença está relacionada com a hipertrigliceridemia, hipertensão arterial, obesidade central, hiperglicemia e diminuição de lipoproteínas de alta densidade 6-8 . Obesidade, diabetes mellitus tipo II (DM II) e dislipidemia são as co-morbidades mais comumente associadas à DHGNA, doença que afeta qualquer faixa etária ou grupo racial. Em pacientes com DHGNA, a prevalência de DM II é de 10-75% e dislipidemia de 20 a 92% 9. Pacientes diabéticos tipo II, independentemente do índice de massa corporal (IMC), têm aumento significativo na prevalência e gravidade da DHGNA 77 . A DHGNA é uma síndrome insidiosa, de difícil detecção através de biópsia hepática e sem biomarcadores clínicos definidos. 98 Conforme os resultados apresentados no artigo Hepatic nitrosative stress in experimental diabetes – Journal of diabetes and its complications, 2012 (artigo I), que objetivou definir algumas vias inflamatórias e de estresse oxidativo no modelo experimental de diabetes, assim como o efeito terapeutico da aminoguanidina, pode-se concluir que o fígado apresenta importantes alterações inflamatórias em um estado de hiperglicemia crônica. O presente estudo utilizou a droga Aminoguanidina (AG), que a partir dos dados apresentados na tabela I (artigo I) não afetou os valores de glicemia dos animais diabéticos. A aminoguanidina atua principalmente como um inibidor dos produtos finais de glicação avançada (AGEs), mas em pequenas doses pode atuar como um inibidor específico da iNOS e possivelmente garantir uma alternativa terapêutica importante para o diabetes 139, 140 . No presente artigo, foi observado um aumento significativo na lipoperoxidação do fígado no grupo DM e uma redução neste marcador de estresse oxidativo ocorreu após tratamento com AG (Tabela 1- artigo I). Observamos que a AG reduziu a lipoperoxidação hepática em animais diabéticos, possivelmente devido a sua atividade antioxidante. Estudos anteriores têm demonstrado que a aminoguanidina reduziu a apoptose induzida por espécies de oxigênio reativas e a lipoperoxidação, em células da retina, rim e tecido pulmonar em animais diabéticos 141-144 . A hiperglicemia estimula a expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS), que é acompanhada pelo aumento da geração de NO. O NO reage com o O 2.-, formando o potente oxidante peroxinitrito, aumentando assim a peroxidação dos lipídios, alterando o metabolismo das proteínas, a oxidação das proteínas de baixa densidade (LDL) e afetando as vias de sinalização e 99 transdução celular 64 . Evidencias experimentais suportam que o NO, as espécies reativas de oxigênio e o peroxinitrito interferem no desenvolvimento do DM agudo antes de iniciarem as complicações da doença 64 . Diversos estudos apontam o envolvimento do NO e do radical superóxido no processo fisiopatológico das complicações crônicas do DM. Estudos demonstram essas alterações no fígado de animais diabéticos induzidos por estreptozotocina 62, 145 . Além disso, aparentemente, NO e outros radicais livres relacionados e espécies oxidantes são os maiores efetores de necrose das células β-pancreáticas 64 . Em nosso estudo, foi observado redução dos níveis desta aumento significativo da expressão da iNOS, e proteína após a administração da AG (Figura 2- artigo I). Esses achados demonstram que a AG exerceu um efeito inibidor seletivo da iNOS nos animais diabéticos e a relevância do estresse nitrosativo hepático na ativação de vias de transcrição pró-inflamatórias. Foi demonstrado em modelo experimental de indução por estreptozotocina o dano mitocondrial hepático ocasionado pela nitração de proteínas. Neste estudo foram analisadas a ultraestrutura mitocondrial dos hepatócitos através da microscopia eletrônica e as expressões da iNOS e da nitrotirosina representando o estresse nitrosativo nos tecido hepático. O grupo de animais diabéticos apresentou um importante dano estrutural nas mitocôndrias hepáticas, assim como aumento das expressões da INOS e da nitrotirosina, podendo relacionar-se a nitração das proteínas ao dano das estruturas mitocondriais. A utilização, neste estudo, da aminoguanidina, droga inibidora da iNOS, demonstrou redução do dano nitrosativo e mitocondrial 146. Considerando-se a importância do estresse nitrosativo e oxidativo hepático no 100 diabetes, a utilização de um agente antioxidante que reduz a formação do radical superóxido, como a orgoteína, ou que inibem a formação excessiva do óxido nítrico, como a aminoguanidina, pode apresentar um benefício terapêutico para essa doença 146 . Em estudo prévio, a administração da orgoteína determinou alterações na atividade de enzimas antioxidantes e no estresse oxidativo, essas alterações não estabeleceram, entretanto, modificações na p65 66. O DM, através do desequilíbrio no estado redox, desencadeia a ativação de fatores de transcrição nuclear como o NFкB. A ativação desse fator é responsável pelo aumento na expressão da iNOS. Em nosso estudo, assim como em outros estudos 62, 66, 144 , ocorreu aumento na expressão da p65 nuclear e da iNOS, demonstrando indiretamente a ativação do NFкB no DM experimental. Além disto, também foi evidenciado o aumento da nitração de proteínas, através do aumento da expressão da nitrotirosina hepática no grupo de animais diabéticos (Figura 2- artigo I). A diminuição da nitração de proteínas no grupo tratado pode estar associada à redução da ativação do NFкB. Estudos experimentais demonstram que a utilização de antioxidantes pode reduzir o estresse oxidativo e inibir a ativação de fatores de transcrição redox-dependentes 62. Com a finalidade de investigar as alterações hepáticas do modelo de diabetes induzido por estreptozotocina, Natsumi e colaboradores (2008) analisaram a expressão de proteínas transportadoras de xenobióticos e componentes da bile e a expressão da p65 do NFĸB. Os autores concluíram que proteínas transportadoras hepáticas alteradas afetam a distribuição de xenobióticos e que o aumento da transcrição do NFĸB é um dos fatores 101 responsáveis. 147 O estudo reforça a importância de fatores redox-dependentes na fisiopatogenia hepática do DM, podendo-se transpor esses dados para a clínica da DHGNA. Estes resultados, que definem o diabetes como doença metabólica essencialmente inflamatória, demonstram a importância do estudo translacional com o modelo de diabetes induzidos pela droga estreptozotocina. O diabetes é um fator associado com a progressão da DHGNA e pacientes considerados não obesos, mas com alterações metabólicas e inflamatórias no fígado apresentam elevado risco de desenvolvimento da DHGNA 148. O estudo demonstrou a importância dos fatores redox dependentes na patogênese de complicações hepáticas no diabetes mellitus e esses dados poderiam contribuir para o manejo clínico da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica. Conforme os resultados apresentados no artigo Obesity depresses the anti-inflammatory HSP70 pathway contributing to the progression of NAFLD in obese patients, submetido à revista Clinical Science (artigo II), pacientes obesos com DHGNA que apresentam um estado de estresse oxidativo e redução da expressão de proteínas de choque térmico desenvolvem a forma inflamatória da doença denominda esteatohepatite não alcoólica (EHNA). O aumento da prevalência mundial de obesidade e a hiperglicemia em jejum são fatores de risco independentes para a DHGNA e ambos os fatores constituem um grande problema de saúde pública149. A Doença Hepática Gordurosa Não Alcóolica (DHGNA) abrange condições patológicas que se sucedem de forma progressiva e levam a esteatose e a sua forma inflamatória, a esteatohepatite, podendo também desencadear fibrose, cirrose e carcinoma 102 hepatocelular 148 . A prevalência da DHGNA varia de 10 a 51%, dependendo da 5, 150 população estudada e da metodologia utilizada . Com base em estimativas, a prevalência da EHNA na população em geral de países ocidentais é cerca de 2 a 3%73. O presente estudo caracteriza a Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica como uma doença de origem sistêmica amplamente relacionada com o estado inflamatório e de estresse celular do tecido adiposo e hepático. O percentual de gordura corporal e parâmetros quantitativos de lipemia como colesterol total e triglicerídeos possuem um papel central na etiopatogenia da DHGNA. No entanto, o presente estudo demonstrou que estes fatores não contribuíram para a evolução da esteatose para EHNA, nem para o desenvolvimento de fibrose hepática em indivíduos com obesidade grave submetidos à cirurgia bariátrica (Tabela 1 – artigo II). Também não houve diferença significativa em relação ao índice de massa corporal (IMC) e o percentual de gordura corporal nos diferentes grupos (Tabela suplementar 1artigo II). A obesidade é o principal fator de desenvolvimento da DHGNA e indivíduos obesos possuem um risco relativo muito maior de adoecer do que indivíduos sem sobrepeso136, 148. No entanto, o percentual de gordura corporal não foi um fator determinante de progressão para a EHNA em pacientes com obesidade grave submetidos à cirurgia bariátrica (Tabela suplementar 1artigo II). A análise de adipocitocinas e outros mediadores inflamatórios já demonstrou ter maior poder preditivo para o desenvolvimento da EHNA do que somente a adiposidade visceral 151 . A partir destes achados a necessidade de avaliar outros fatores inflamatórios no tecido que não a lipemia ou o percentual de gordura corporal se faz necessária. 103 A progressão da Doença Hepática Gordurosa não Alcoólica ficou caracterizada através da análise dos marcadores da função hepática AST e ALT. Além da caracterização histológica dos grupos (Figura suplementar 1 – artigo II), a avaliação destes marcadores foi fundamental para a determinação da gravidade da doença150. Os pacientes com fibrose hepática apresentaram fundamentalmente níveis de ALT elevados (Tabela 1- artigo II) caracterizando a gravidade da doença. No presente estudo, demonstramos mais uma vez a importante relação entre a resistência insulínica induzida pela obesidade e o estado inflamatório e de estresse oxidativo relacionado com esta condição 152. Pacientes com esteatohepatite apresentaram piora na resistência insulínica e no controle glicêmico crônico avaliado através dos níveis de hemoglobina glicada (Tabela 1 – artigo II). Já foram descritas relações entre o estresse mitocondrial e a geração de espécies reativas de oxigênio em doenças metabólicas como o diabetes no fígado e no tecido adiposo 100. Na DHGNA, o estresse oxidativo possui papel fundamental para a progressão de um estado de esteatose pura para o desenvolvimento da forma inflamatória da doença 151. No presente estudo foi observada uma elevação da lipoperoxidação sistêmica dos pacientes do grupo que desenvolveu esteatohepatite e no grupo de pacientes com esteatohepatite e desenvolvimento de fibrose quando comparados ao grupo esteatose (Tabela 1- artigo II) e uma redução da atividade a enzima antioxidante superóxido dismutase (SOD) no grupo esteatohepatite quando comparado ao grupo esteatose (Tabela 1- artigo II). A atividade da SOD reduzida pode ser explicada pela glicação avançada da proteína hemoglobina no estado de hiperglicemia crônica 66. A atividade da enzima SOD apresentou 104 leve aumento no grupo com desenvolvimento de fibrose, podendo ser explicado através do estresse crônico a que este grupo está exposto. O estresse oxidativo mitocondrial, associado à disfunção e estresse do retículo endoplasmático (RE) são fatores para o aumento da expressão e ativação da JNK e NF-κB e para o desenvolvimento de um estado próinflamatório152-154. Neste contexto, foi demonstrado (artigo I – Hepatic nitrosative stress in experimental diabetes) que o aumento do estresse oxidativo e nitrosativo são as principais causas para o desequilíbrio redox e ativação do NFƙB com consequente dano hepático. Em condições de supernutrição, o adipócito decompõe o seu RE e, após um ponto crítico, começa a fornecer proteínas mal formadas. Para conter este dano, o RE do adipócito gera uma resposta à proteínas mal formadas 97, 98 . Esta resposta resulta na inibição seletiva na síntese de novas proteínas, na transcrição de chaperonas e na ativação do c-Jun N-terminal cinase (JNK). A ativação do JNK conduz a uma variedade de efeitos, tal como a apoptose, inflamação e resistência à insulina 99. No presente estudo ficou mais uma vez evidenciado o papel da ativação da JNK no desenvolvimento da resistência insulínica pelo tecido adiposo e a progressão da EHNA. A expressão e ativação da JNK1 hepática ficou mais evidente no grupo com desenvolvimento de esteatohepatite, o que pode ser um indicativo importante do envolvimento desta proteína na progressão da doença, (Figura 2- artigo II) de forma consistente com a evidência de que a JNK1, em detrimento da JNK2, promove o desenvolvimento e agravamento da DHGNA111. No tecido adiposo, a ativação tanto da JNK1 quanto da JNK2 foram mais evidentes conforme a progressão para a EHNA (Figura 1- artigo II). 105 No entanto, este estudo demonstra pela primeira vez a redução relativa da expressão da HSP70 no tecido adiposo (Figura 1- artigo II) e fígado (Figura 2- artigo II) de pacientes obesos com esteatohepatite quando comparados com pacientes com esteatose pura . Também ficou evidenciado no tecido adiposo e fígado a redução do Fator de transcrição das proteínas de choque térmico (Heat shock transcription factor 1 – HSF-1) nos pacientes com esteatohepatite (Figuras 1 e Figura 3 D, E e F – artigo II). Isto demonstra que estes pacientes provavelmente desenvolveram piora do quadro clínico da EHNA por possuírem uma defesa insuficiente contra o estresse celular. O diabetes mellitus tipo II está relacionado com uma baixa expressão do HSF-1 e dos níveis e expressão da HSP nos tecidos sensíveis a insulina 121. Uma sinalização alterada da insulina nestes pacientes reprime a atividade da HSF-1 através do aumento da expressão da JNK155. A expressão da HSP70 é fundamental para o bloqueio de fatores de transcrição pró-inflamatórios e para ativação da JNK 122 . Esta disfunção nas defesas contra o estresse ocorreu tanto no tecido adiposo quanto no fígado e desta forma demonstrou contribuir para a resistência insulínica e para a progressão da EHNA no presente estudo (Tabela 1 e figuras 1 e 2 - artigo II). Em tecidos de mamíferos, a HSP70 é expressa tanto constitutivamente (HSP73 ou Hsc70) quanto de uma forma indutível ao estresse (HSP72) 156. Embora ambas as formas da HSP70 são chaperonas moleculares que funcionam com propriedades anti-inflamatórias, situações de estresse que perturbam a homeostase celular (por exemplo choque térmico, metais pesados, os sinais inflamatórios) podem desencadear rapidamente a transcrição dependente do HSF-1 de grandes quantidades de HSP72 para contrapor tais 106 agravos celulares 68. Portanto, a redução da capacidade de expressão induzida pelo estresse da HSP72 está no centro da origem da inflamação e resistência à insulina no músculo esquelético e no tecido adiposo de pacientes obesos 157 121, . De fato, tem sido demonstrado que a expressão da HSP72 é fundamental para bloquear a inflamação e prevenir a resistência à insulina no contexto da obesidade genética ou alimentação rica em gordura 107 . No presente estudo foi observada no fígado uma expressão positiva da forma indutível HSP72 somente no grupo de pacientes com esteatose (figura 2- artigo II)e sugerimos que este possa ser considerado um fator de proteção para a progressão à esteatohepatite. No presente estudo, com o objetivo de avaliar o tipo celular e a distribuição tecidual hepática das HSPs foi realizada a marcação por imunofluorescência das proteínas HSF-1, HSP70 e a co-marcação das células CD14 positivas. Foi demonstrado que a expressão da HSP70 foi significativamente e progressivamente diminuindo em células de Kupffer CD14+ de pacientes com DHGNA a partir do grupo esteatose até esteatohepatite e fibrose (Figuras 3 e 4 A, B e C – artigo II). Embora não seja completamente compreendida, a geração de radicais livres pode agravar a inflamação através da ativação das células Kupffer. Além disso, foi recentemente demonstrado que a resposta pró-inflamatória das células de Kupffer pode ser responsável pela a gravidade da esteatose hepática e a sua progressão para EHNA, fibrose, cirrose e, eventualmente, carcinoma hepatocelular 158 . Neste contexto, evidências sugerem que as células de Kupffer contribuem criticamente para a progressão da DHGNA reconhecendo a 107 injúria nos hepatócitos com esteatose e promovendo consequentes respostas inflamatórias 159. Em conjunto, as proposições do presente estudo sugerem um efeito causal de diminuição da expressão HSF-1 sobre HSP72 para a progressão da EHNA, uma vez que a expressão da HSP72 é totalmente dependente da indução da via HSF-1160. Consequentemente, as vias pró-inflamatórias ativadas pela JNK podem ser reprimidas, resultando em aumento do estresse oxidativo e agravamento da doença, na medida em que o HSF-1 pode suprimir a expressão de mediadores de inflamação 161 , de forma que qualquer elemento que quebre o equilíbrio do HSF-1 através de vias bioquímicas, facilmente desencadeia um ciclo vicioso de inflamação, estresse oxidativo e consequente dano ao tecido. Portanto, o presente estudo demonstrou o envolvimento do estresse oxidativo sistêmico e de alterações inflamatórias do fígado e tecido adiposo na progressão da EHNA. Também ficou evidenciado o papel da expressão regular das proteínas de choque térmico como fatores de proteção no tecido hepático e adiposo em pacientes com DHGNA. Nesta população, o aumento do estresse celular e a baixa expressão das proteínas de choque térmico contribuíram para a maior expressão da JNK, para o agravamento da resistência insulínica e para um estágio mais avançado da DHGNA. 108 CONCLUSÃO Pelos resultados obtidos nos trabalhos realizados concluiu-se que: No artigo I: O modelo experimental de indução de diabetes através da droga estreptozotocina promove alterações hepáticas relacionadas com o aumento de estresse oxidativo avaliado através da lipoperoxidação hepática. Também foi visto aumento do estresse nitrosativo, representado pelo aumento da expressão da iNOS e da nitrotirosina, que levaram à ativação do NFƙB. Estas alterações foram revertidas com a utilização de um inibidor específico da iNOS, o que evidencia a importância do estresse nitrosativo nas alterações hepáticas relacionadas ao diabetes. No artigo II: Pacientes obesos com DHGNA apresentam aumento do estresse oxidativo sistêmico que contribui para a progressão da EHNA. A redução da via HSF-1/HSP70 no fígado e tecido adiposo também determinou um estado próinflamatório representado pela ativação da JNK, uma estado de resistência insulínica, progressão da esteatohepatite e desenvolvimento de fibrose hepática. A obesidade e o diabetes promovem aumento do estresse oxidativo hepático e deprimem a via anti-inflamatória HSP70 contribuindo para a progressão da DHGNA. 109 PERSPECTIVAS FUTURAS As evidências encontradas neste estudo, assim como em estudos anteriores demonstram a importância das vias de transcrição relacionadas ao estado redox e à expressão das proteínas de choque térmico para o desencadeamento e progressão de diversas doenças. Na Doença Hepatica Gordurosa Não Alcoólica as evidências de que estas vias estão envolvidas não somente no tecido hepático, mas também no tecido adiposo para a progressão da doença, são determinantes para o surgimento de novas pesquisas e intervenções. O estudo da relação intra extracelular da HSP70 pode ser um marcador de prognóstico de fácil obtenção a partir do sangue periférico, ao contrário da biópsia hepática, que ainda é a principal forma de estadiamento da doença. O estudo de novos biomarcadores moleculares relacionados a senescência celular do tecido adiposo e dos hepatócitos também é uma linha de pesquisa que se abre a partir destes resultados e de resultados publicados recentemente. O estudo das citocinas SASP - senescence-associated secretion phenotype, HuR e SIRT1 e como estas vias podem inibir a ativação do HSF-1 seriam perspectivas futuras aos presentes achados. 110 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. James PT, Leach R, Kalamara E, Shayeghi M. The worldwide obesity epidemic. Obesity research 2001; 9 Suppl 4: 228S-233S. Freitas LRSd, Garcia LP. Evolução da prevalência do diabetes e deste associado à hipertensão arterial no Brasil: análise da Pesquisa Nacional por Amostra de Domicílios, 1998, 2003 e 2008. Epidemiol. Serv. 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Benefícios previstos: Conhecimento sobre a condição de saúde do fígado e controle e tratamento da doença hepática gordurosa não alcoólica. Os resultados serão apresentados e discutidos com a equipe de saúde responsável. Declaro que fui informado dos objetivos, procedimentos, riscos e benefícios desta pesquisa. Entendo que terei garantia de confidencialidade, ou seja, que apenas dados consolidados serão divulgados e ninguém, além dos pesquisadores terá acesso aos nomes dos participantes da pesquisa. Entendo também que tenho direito a receber informação adicional sobre o estudo a qualquer momento, mantendo contato com o pesquisador principal e/ou orientador da pesquisa. Fui informado, ainda, que a participação é voluntária e se preferir não participar ou deixar de participar deste estudo a qualquer momento a equipe de pesquisa compreenderá a opção. Declaro, também, que compreendo tudo o que me foi explicado sobre o estudo a que se refere este documento. Assinatura do participante:................................................................................................. Assinatura do pesquisador responsável:........................................................................... Porto Alegre .........de...............de 20___. Pesquisador: