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Desenvolvimento de soja tolerante à seca e avaliação preliminar de biossegurança alimentar da proteína AtDREB1A

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Desenvolvimento de soja tolerante à seca e avaliação preliminar de biossegurança alimentar da proteína AtDREB1A

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Título Desenvolvimento de soja tolerante à seca e avaliação preliminar de biossegurança alimentar da proteína AtDREB1A
Autor Beneventi, Magda Aparecida
Orientador Grossi-de-Sá, Maria Fátima
Nepomuceno, Alexandre Lima
Data 2010
Nível Doutorado
Instituição Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Centro de Biotecnologia do Estado do Rio Grande do Sul. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular.
Assunto Arabidopsis thaliana
Soja
Transgênicos
Resumo Um dos grandes desafios da pesquisa agrícola atual é desenvolver estratégias para obtenção de plantas mais tolerantes, portanto, continuar ampliando o conhecimento sobre os mecanismos pelos quais as plantas respondem à seca, é essencial para a identificação de rotas metabólicas envolvidas no processo de defesa e o desenvolvimento de genótipos cada vez mais adaptados. Neste trabalho, para a obtenção de plantas de soja tolerantes à seca, a construção RD29A:AtDREB1A a qual confere tolerância ao déficit hídrico foi inserida em cultivares de soja e a biossegurança alimentar da proteína DREB1A/CBF3 de A. thaliana foi avaliada. Também, os extratos protéicos das plantas submetidas ao estresse hídrico foram comparados para a identificação de proteínas de soja diferencialmente expressas que podem estar envolvidas nas respostas à seca. A avaliação de biossegurança alimentar da proteína AtDREB1A in silico mostrou que a proteína não possui características de toxicidade, alergenicidade, antinutricionais, ou sítios de N-glicosilação, assim como, de atividade hemolítica sob eritrócitos de humanos atestado com a proteína AtDREB1A produzida in vitro, indicando ausência de efeitos adversos. A inserção da construção RD29A:AtDREB1A e RD29A:GUS em soja, demonstrou que o promotor RD29A e o fator de transcrição AtDREB1A de A. thaliana são ativados aumentando a tolerância ao déficit hídrico em soja. Vinte linhagens transgênicas foram obtidas por biobalística e apresentaram estabilidade do transgene. Análises histoquímicas confirmaram a indução do promotor RD29A em condições de desidratação e o aumento de expressão de genes de soja GmPip1 GmGols regulados pela proteína DREB1A também foi confirmado por RT-qPCR. Diferenças anatômicas significativas não foram observadas. Em média, os parâmetros fisiológicos foram superiores nas linhagens transgênicas, quando comparadas à sua isolinha BR16. Embora características agronômicas mais adaptativas relacionadas à produção não foram evidentes em casa de vegetação, há uma boa indicação de que a estratégia pode melhorar a tolerância à seca em plantas de soja. Para isso, experimentos a campo já estão sendo conduzidos para uma melhor caracterização agronômica e fisiológica. Na busca por ampliar os conhecimentos sobre os eventos envolvidos nas respostas à seca, a comparação dos extratos protéicos de soja BR16 não transgênica e BR16(P58) geneticamente modificada (GM) com a construção RD29A:AtDREB1A em condições controle e sob déficit hídrico, possibilitou a identificação de “spots” comuns aos dois tratamentos assim como de “spots” diferencialmente expressos, através da metodologia de 2-DE. Nos tratamentos de déficit hídrico, 25 “spots” foram identificados em BR16 não GM e 34 “spots” em P58 GM, entretanto, análises de espectrometria de massa ainda estão em andamento e pesquisas em bancos dados serão fundamentais para a identificação das proteínas diferencialmente expressas em resposta ao déficit hídrico.
Abstract One of the challenges in agriculture is to develop strategies to obtain plants with higher drought tolerance. Therefore, the identification of metabolic pathways and understanding of the mechanisms by which plants respond to drought is an essential tool for the development of more adapted genotypes. In this work, the RD29A:AtDREB1A genetic construct which was reported to confer water deficit tolerance was inserted into soybean cultivars, and the food safety of Arabidopsis thaliana AtDREB1A/CBF3 protein was evaluated. Also, protein extracts from soybean plants submitted to water stress conditions were compared to identify differentially expressed soybean proteins involved in drought responses. The in silico evaluation of AtDREB1A protein showed that the protein has no evidence of toxicity, allergenicity, antinutritional features or N-glycosylation sites. No hemolytic activity on human erythrocytes assayed in vitro with AtDREB1A protein was detected, indicating no adverse effects. The insertion of RD29A:AtDREB1A and RD29A:GUS constructs in soybean showed that the RD29A stress-inducible promoter and the AtDREB1A transcription factor were activated and improved drought tolerance in soybean. Using bioballistic transformation, we obtained twenty stably transformed soybean lines. Histochemical analysis confirmed the induction of the RD29A promoter under dehydration conditions and increased expression of two soybean genes activated by AtDREB1A GmPip1 and GmGols were confirmed by RTqPCR. No anatomical differences were observed. On average, physiological parameters were superior in the transgenic line BR16(P58) when compared to the isoline BR16. Although agronomic traits related to higher adaptive production were not evident in greenhouse, there is a good indication that the strategy can improve drought tolerance in soybean. To establish trait efficacy, field experiments are already being conducted to obtain relevant agronomic and physiological data. To better understand the molecular events involved in drought responses, a comparison using protein extracts from genetically modified (GM) BR16(P58) and non-GM soybean BR16 in watered control conditions and under water deficit treatment allowed the identification of common proteins to both treatments as well as of proteins that are differentially expressed between treatments using 2-dimension gel electrophoresis (2-DE). In the water deficit treatment 25 differentially expressed protein spots were identified in non-GM isoline BR16 and 34 spots in BR16(P58). Subsequent analysis of these spots using mass spectrometry is still been conducted and peptide information in available public databases will be essential for identification of differentially expressed proteins.
Tipo Tese
URI http://hdl.handle.net/10183/72373
Arquivos Descrição Formato
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