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Application of 6-nitrocoumarin as a substrate for the fluorescent detection of nitroreductase activity in Sporothrix schenckii

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Application of 6-nitrocoumarin as a substrate for the fluorescent detection of nitroreductase activity in Sporothrix schenckii

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Título Application of 6-nitrocoumarin as a substrate for the fluorescent detection of nitroreductase activity in Sporothrix schenckii
Outro título Aplicação de 6-nitrocumarina como substrato fluorescente para detecção de atividade nitroredutásica em Sporothrix schenckii
Autor Stopiglia, Cheila Denise Ottonelli
Carissimi, Mariana
Daboit, Tatiane Caroline
Stefani, Valter
Corbellini, Valeriano Antonio
Scroferneker, Maria Lucia
Resumo Introdução: Sporothrix schenckii é um fungo dimórfico térmico, agente etiológico de micose subcutânea, a esporotricose. Nitrocumarina representa classe de substratos fluorogênicos em que a atividade nitroredutásica microbiana produz vários derivados, já utilizados em vários outros ensaios enzimáticos. O objetivo deste estudo foi analisar 6-nitrocumarina (6-NC) como substrato para estudo da atividade nitroredutásica em Sporothrix schenckii. Métodos: Trinta e cinco isolados de S. schenckii foram cultivados por sete, 14 e 21 dias a 35 °C em um microcultivo contendo 6-nitrocumarina ou 6-aminocumarina (6-AC) solubilizada em dimetilsulfóxido ou dimetilsulfóxido como controle negativo, para posterior análise em microscópio de epifluorescência. A fase orgânica da cultura de sete, 14 e 21 dias foi analisada por meio de iluminação direta com luz UV de 365 nm e por eluição em placas de sílica gel G com hexano:acetato de etila 1:4 e revelada com luz UV. Resultados: Todos os isolados mostraram a presença de 6-AC (fluorescência amarela) e 6-hidroxilaminocumarina (fluorescência azul) em cromatografia em camada delgada, que explica a fluorescência verde observada na estrutura dos fungos. Conclusão: A atividade nitroredutásica é amplamente distribuída no complexo S. schenckii e 6-NC é um substrato fluorogênico de fácil obtenção e aplicabilidade para detecção da atividade nitroredutásica.
Abstract Sporothrix schenckii is a thermal dimorphic pathogenic fungus causing a subcutaneous mycosis, sporotrichosis. Nitrocoumarin represents a fluorogenic substrate class where the microbial nitroreductase activity produces several derivatives, already used in several other enzyme assays. The objective of this study was the analysis of 6-nitrocoumarin (6-NC) as a substrate to study the nitroreductase activity in Sporothrix schenckii. Methods: Thirty-five samples of S. schenckii were cultivated for seven, 14 and 21 days at 35 °C in a microculture containing 6-nitrocoumarin or 6-aminocoumarin (6-AC) dissolved in dimethyl sulfoxide or dimethyl sulfoxide as a negative control, for posterior examination under an epifluorescence microscope. The organic layer of the seven, 14 and 21-day cultures was analyzed by means of direct illumination with 365 nm UV light and by means of elution on G silica gel plate with hexane:ethyl acetate 1:4 unveiled with UV light. Results: All of the strains showed the presence of 6-AC (yellow fluorescence) and 6-hydroxylaminocoumarin (blue fluorescence) in thin layer chromatography, which explains the green fluorescence observed in the fungus structure. Conclusion: The nitroreductase activity is widely distributed in the S. schenckii complex and 6-NC is a fluorogenic substrate of easy access and applicability for the nitroreductase activity detection.
Contido em Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. São Paulo. Vol. 55, no. 5 (Sept./Oct. 2013), p. 353-356
Assunto Cumarinicos
Esporotricose
Química orgânica
Sporothrix : Enzimologia
[en] 6-nitrocoumarin
[en] Enzymatic activity
[en] Fluorogenic substrate
[en] Sporotrichosis
Origem Nacional
Tipo Artigo de periódico
URI http://hdl.handle.net/10183/87968
Arquivos Descrição Formato
000904926.pdf (454.9Kb) Texto completo (inglês) Adobe PDF Visualizar/abrir

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